郭震，陶永剛，陳棉彪，黃楚珊，張麗娟，胡國成,*

1. 錦州醫(yī)科大學，錦州 121001 2. 生態(tài)環(huán)境部華南環(huán)境科學研究所，廣州 510535 3. 國家環(huán)境保護環(huán)境污染健康風險評價重點實驗室，廣州 510535

自從1908年G.A. Engelard等用天然橡膠與氯氣反應合成阻燃氯化橡膠以來，阻燃劑技術獲得了迅猛發(fā)展，國際市場上開發(fā)出許多新型、高效的阻燃劑[1]。目前，至少有75種溴代阻燃劑(BFRs)在市場上進行了商品化，由于這些外源性污染物具有持久性、蓄積性、生物毒性及“三致效應”，無意釋放到環(huán)境會對人類健康造成潛在威脅[2-3]。FM550是美國科聚亞公司2003年生產(chǎn)的添加型溴代阻燃劑，廣泛應用于聚氨酯泡沫、兒童用品及汽車飾品中[4]。FM550成分比較復雜，主要包括2-乙基己基-四溴苯甲酸(TBB)、2,3,4,5-四溴-苯二羧酸雙(2-乙基己基)酯(TBPH)、磷酸三苯酯(TPP)及其類似物(iTPP)[5]。TBB能在生物體內代謝為四溴苯甲酸(TBBA)[6]；TBPH在光的作用下可降解為一種增塑劑——鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)，能干擾機體脂肪酸代謝及甲狀腺激素水平，對生態(tài)環(huán)境和人體健康產(chǎn)生潛在風險[7]。

FM550作為PBDEs的主要替代品，主要添加到家具、兒童用品及汽車飾品中[8]。有研究資料顯示，TBB和TBPH在地表水、環(huán)境空氣、土壤和室內積塵等環(huán)境介質中均有不同程度的檢出[9-11]；在水生生物、海洋哺乳動物體內也有積累富集[12]。此外，F(xiàn)M550還可以通過大氣傳輸進行長距離遷移[13]。

本研究利用傳統(tǒng)毒理學研究方法，以羅非魚作為實驗對象，通過飼料添加不同濃度的FM550進行口服攝入染毒。由于FM550在國內較難購買，本研究參照Patisaul等[14]和Saunders等[15]的實驗方法，將TBB和TBPH的1∶1混合物用于替代FM550。筆者深入研究了FM550暴露對魚類甲狀腺激素以及血清生理生化指標的影響，為新型溴代阻燃劑FM550的使用提供毒理學資料，為FM550環(huán)境管理及控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試生物

實驗用尼羅羅非魚購于廣東省羅非魚良種場。將羅非魚飼養(yǎng)于羅非魚養(yǎng)殖系統(tǒng)，每日投喂飼料3次，飼養(yǎng)水溫控制在(25±1) ℃，光暗比為14 h：10 h。飼養(yǎng)一周后選取體型相近、健康活潑的個體供試。

1.2 實驗試劑

2-乙基己基-四溴苯甲酸(TBB)純度為99%，2,3,4,5-四溴-苯二羧酸雙(2-乙基己基)酯(TBPH)純度為99%，均購于百靈威試劑公司。

1.3 儀器設備

全自動化學發(fā)光免疫分析儀(CENTAURXP，美國西門子公司)；全自動生化分析儀(Cobas702，瑞士羅氏公司)；血細胞分析儀(XE5000，日本希森美康公司)；電子分析天平(0.1 mg/0.01 mg，MU105DU，瑞士梅特勒托利多公司)；低溫冷凍離心機(Sorvall Stratos，美國賽默飛世爾科技公司)。

1.4 試驗方法

1.4.1 暴露實驗

將飼料原料粉碎后，過80目標準篩，然后按所需量稱重后混勻，在此過程中，分別按照0、10、100和400 ng·g-1的添加量加入TBB和TBPH的1∶1混合物的丙酮溶液。暴露實驗在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行，將前期選擇的480尾羅非魚進行分組養(yǎng)殖，分成1個對照組以及低、中、高3個暴露組，每組4個平行，每個平行30尾魚。實驗期間每天均測定養(yǎng)殖水的基本參數(shù)以保證羅非魚有一定適宜程度的生長環(huán)境，經(jīng)每天測定實驗期間水溫，基本維持在25 ℃左右，明暗控制為14 h 光：10 h 暗。養(yǎng)殖期間，每天在10:00、14:00和18:00分3次進行投喂，每日的投喂量為魚體重的8%，在每次喂食0.5 h后，用虹吸管將養(yǎng)殖缸底部飼料殘渣及糞便吸出，暴露期為56 d。

1.4.2 樣品采集

暴露實驗結束后，每個平行選取3尾羅非魚，測量每尾魚的體重、體長和體高。使用1 mL的一次性無菌注射器對羅非魚進行尾靜脈取血，靜置4 h后，用離心機以4 000 r·min-1的速度離心15 min，將上層血清吸出后，轉移到-80 ℃的冰箱中保存，用于甲狀腺激素以及血清生理生化指標的測定。此外，使用抗凝取血管取全血，進行全血生理生化指標的測定。

1.4.3 指標的測定

血清中的甲狀腺激素使用全自動化學發(fā)光免疫分析儀進行測定，使用的方法為化學發(fā)光法，主要的測定指標為三碘甲狀腺原氨酸(T3)、四碘甲狀腺原氨酸(T4)、游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、游離四碘甲狀腺原氨酸(FT4)和促甲狀腺激素(TSH)。血清中的生理生化指標使用羅氏全自動生化分析儀進行測定，測定的指標為谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、谷草轉氨酶/谷丙轉氨酶(AST/ALT)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)和低密度脂蛋白(LDL-C)。全血的生理生化指標使用血細胞分析儀進行測定，主要指標為白細胞計數(shù)(WBC)、紅細胞計數(shù)(RBC)、血紅蛋白測定(Hb)和血小板計數(shù)(PLT)。以上指標的測定均嚴格按照儀器操作規(guī)程操作，并按照試劑說明書設置參數(shù)。檢測前進行常規(guī)校準，并確定高、中、低3種室內質控水平全部在控。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析，用平均值±標準誤(mean±se)來表示實驗數(shù)據(jù)，用Dunnett’s t檢驗進行多重比較，當P<0.05時表示有顯著性差異。

2 結果與分析(Resuls and analysis)

2.1 FM550對羅非魚生長指標的影響

羅非魚的初始體重、體長如表1所示，各暴露組在暴露之前體重、體長差別均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 羅非魚的初始生長數(shù)據(jù)(平均值±標準誤)Table 1 The initial growth data of tilapia

含不同濃度的FM550飼料飼喂56 d后，羅非魚的基本生長指標(體重、飼料系數(shù)、肝體比、脂體比、肥滿度和存活率)的變化如圖1所示。在羅非魚暴露于不同濃度FM550 56 d后，各暴露組與對照組差異并無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，這說明不同濃度的FM550暴露在56 d內對羅非魚的基本生長指標影響不大。

圖1 FM550對基本生長指標的影響Fig. 1 Effects of FM550 on basic growth index of tilapia

2.2 FM550對羅非魚血清中甲狀腺激素的影響

2.2.1 FM550對羅非魚血清中T3和T4含量的影響

不同濃度的FM550飼料暴露對羅非魚血清中T3和T4含量的影響如圖2所示，羅非魚暴露于不同濃度FM550 56 d后，隨著暴露濃度的增加，羅非魚血清中T3含量逐漸降低，T4含量先降低后升高。相對于對照組，高濃度暴露組血清中T3含量顯著降低(P<0.05)，T4含量升高，但差異并無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。低、中濃度暴露組血清中T3、T4含量均降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，T4含量與對照組相差不大(P>0.05)。高濃度FM550暴露對T3抑制率最高達到了45.96%，對T4的促進率最高達到了20.91%。

圖2 FM550對血清中三碘甲狀腺原氨酸(T3)和四碘甲狀腺原氨酸(T4)含量的影響注：“*”表示實驗組與對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。Fig. 2 Effects of FM550 on the contents of triiodothyronine (T3) and tetraiodothyronine iodine (T4) in serumNote: “*” indicates significant difference between the treatment and the control (P<0.05).

2.2.2 FM550對羅非魚血清中FT3和FT4含量的影響

不同濃度的FM550飼料暴露對羅非魚血清中FT3和FT4含量的影響如圖3所示，羅非魚暴露于不同濃度FM550 56 d后，隨著暴露濃度的增加，羅非魚血清中FT3含量逐漸降低，F(xiàn)T4含量先降低后升高。相對于對照組，高濃度暴露組血清中FT3含量顯著降低(P<0.05)，低、中濃度暴露組FT3含量降低，但差異并無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。相對于對照組，高濃度暴露組的FT4含量升高且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，低、中濃度暴露組血清中FT3、FT4含量均降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。相對于對照組，高濃度組FM550暴露對FT3抑制率最高達到了30.03%，對FT4的促進率最高達到了77.98%。

圖3 FM550對血清中的游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)和游離四碘甲狀腺原氨酸(FT4)的含量影響注：“*”表示實驗組與對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。Fig. 3 Effects of FM550 on the contents of free triiodothyronine (FT3) and free tetraiodothyronine (FT4) in serumNote: “*”indicates significant difference between the treatment and the control (P<0.05).

2.2.3 FM550對羅非魚血清中TSH含量的影響

不同濃度的FM550飼料暴露對羅非魚血清中TSH含量的影響如圖4所示，羅非魚暴露于不同濃度FM550 56 d后，隨著暴露濃度的增加，羅非魚血清中的TSH含量并無明顯變化。

圖4 FM550對血清中的促甲狀腺激素(TSH)的含量影響Fig. 4 Effects of FM550 on the contents of thyroid stimulating hormone (TSH) in serum

2.3 FM550對羅非魚血清中生理生化指標的影響

2.3.1 FM550對羅非魚血清中AST和ALT含量的影響

不同濃度的FM550飼料暴露對羅非魚血清中AST和ALT含量的影響如圖5所示，羅非魚暴露于不同濃度FM550 56 d后，隨著暴露濃度的增加，血清中的ALT含量值并無顯著性變化(P>0.05)，說明FM550的暴露對羅非魚的ALT含量影響不大。羅非魚暴露于FM550 56 d后，隨著暴露濃度的增加，血清中的AST含量值并無顯著性變化(P>0.05)，說明FM550暴露對羅非魚的AST含量影響不大。

圖5 FM550對血清中的谷丙轉氨酶(AST)和谷草轉氨酶(ALT)的含量影響Fig. 5 Effects of FM550 on the contents of aspartate transaminase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) in serum

2.3.2 FM550對羅非魚血清中TC、TG含量的影響

不同濃度的FM550飼料暴露對羅非魚血清中TC和TG含量的影響如圖6所示，羅非魚暴露于FM550 56 d后，各處理組的TC、TG均值低于對照組，而且均有顯著性差異(P<0.05)，而且高劑量組的TC、TG含量均為最低，相對于對照組，高濃度暴露組對TC的抑制率達到了80.7%，對于TG的抑制率達到了28.8%。

圖6 FM550對血清中的總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)的含量影響注：“*”表示實驗組與對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。Fig. 6 Effects of FM550 on the contents of total cholesterol (TC) and triglyceride (TG) in serumNote: “*” indicates significant difference between the treatment and the control (P<0.05).

2.3.3 FM550對羅非魚血清中HDL-C、LDL-C含量的影響

不同濃度FM550飼料暴露對羅非魚血清中HDL-C和LDL-C含量的影響如圖7所示，羅非魚暴露于不同濃度FM550 56 d后，與對照組相比，高濃度組的HDL-C值升高，并且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而中、低濃度的HDL-C值與對照組相比并無顯著性差異(P>0.05)。這說明高濃度的FM550暴露會導致魚HDL-C含量的升高。羅非魚暴露于不同濃度FM550 56 d后，與對照組相比，高濃度的FM550暴露會導致魚LDL-C的含量降低，并且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這說明高濃度的FM550暴露會導致魚LDL-C含量的降低。

圖7 FM550對血清中的高密度脂蛋白(HDL-C)和低密度脂蛋白(LDL-C)的含量影響注：“*”表示實驗組與對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。Fig. 7 Effects of FM550 on the contents of high density lipoprotein (HDL-C) and low density lipoprotein (LDL-C) in serumNote: “*” indicates significant difference between the treatment and the control (P<0.05).

2.4 FM550對魚全血生理生化指標的影響

FM550對魚全血的生理生化指標影響如表2所示，羅非魚暴露于FM550 56 d后，各暴露組與對照組相比，各項指標均無統(tǒng)計學差異。這說明FM550的暴露并不會導致魚全血生理生化指標的變化。

3 討論(Discussion)

魚類的生長指標是反映魚類生長狀況的基礎指標，本實驗結果表明，經(jīng)過56 d的不同濃度FM550暴露后，各組間實驗動物的體重、飼料系數(shù)、肥滿度、脂體比、臟體比以及存活率均未產(chǎn)生顯著性差異，說明在56 d的暴露期內，不同濃度FM550的暴露對實驗動物的基本生長狀況影響不大。

甲狀腺是動物體內的重要腺體，主要依靠T3和T4來調節(jié)生物體作用[16]，其中T3是甲狀腺激素的主要活動形式，T3進入細胞后與細胞核內的甲狀腺受體結合，作用于轉錄過程，實現(xiàn)其對靶基因的正性/負性調控，以調節(jié)機體的生長發(fā)育和代謝平衡[17]，但T3與T4并不具有生物活性，要通過轉化形成FT3和FT4后才能進入細胞[15]。一些實驗表明，F(xiàn)M550可以擾亂甲狀腺素在機體內的穩(wěn)定狀態(tài)[18]。本實驗發(fā)現(xiàn)，對于羅非魚進行FM550的高濃度暴露可導致羅非魚血清內的T3含量降低，T4水平升高?？梢酝普揊M550會對羅非魚甲狀腺激素的分泌與合成產(chǎn)生促進作用，并且可以抑制T4向T3轉化。隨著FM550的暴露濃度的增加，羅非魚游離甲狀腺激素FT3含量呈降低趨勢，F(xiàn)T4的含量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。Patisaul等[14]研究發(fā)現(xiàn)，將大鼠暴露于FM550后，大鼠血清中的T4水平升高且T3水平不變。McGee等[19]研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚暴露于FM550后，斑馬魚血清中的T4和T3水平均升高，F(xiàn)T3含量升高，F(xiàn)T4含量降低。以上研究結果表明，F(xiàn)M550會對甲狀腺激素產(chǎn)生一定的干擾作用，但以上結果與本研究有一定差異，這可能與暴露時間、暴露劑量以及研究對象的代謝轉化效果不同有關。但這些研究結果均驗證了FM550的暴露會影響甲狀腺激素的內穩(wěn)態(tài)水平。不過，目前FM550對甲狀腺作用的具體機制還不是很明確，還需要進一步的實驗研究來論證。

表2 FM550對全血生理生化指標含量的影響(平均值±標準誤)Table 2 Effects of FM550 on the contents of physiological indexes and biochemical indicators in the blood

注：WBC表示白細胞計數(shù)，RBC表示紅細胞計數(shù)，Hb表示血紅蛋白，Plt表示血小板計數(shù)。

Note: WBC means white blood cell; RBC means red blood cell; Hb means hemoglobin; Plt means blood platelet.

ALT和AST是機體內2種十分重要的轉氨酶，主要存在于機體的細胞核及線粒體中，平時一般在血清中含量極低[20]。只有在肝臟細胞受到損傷后，才會大量釋放入血，引起血清中ALT及AST的含量升高，因此，一般將ALT和AST在血清內的含量作為肝臟受到損傷的敏感指標[21]。而在本實驗中發(fā)現(xiàn)，各暴露組的AST、ALT水平與對照組相比并無顯著性差異，說明FM550對肝臟并無明顯損傷作用。羅非魚血清中的TC、TG、HDL-C和LDL-C水平可以反映出羅非魚的脂代謝水平，在本實驗中發(fā)現(xiàn)，對羅非魚進行FM550的高劑量暴露會導致羅非魚血清TC、TG含量降低，HDL-C含量升高，LDL-C的含量降低，結合羅非魚的基本生長數(shù)據(jù)并無明顯差異的情況，可推論由于在FM550暴露時，羅非魚耗能增多，導致羅非魚脂肪消耗增多。但FM550對于羅非魚脂代謝改變的具體機制還需要進一步的實驗來論證。

雖然，動物的全血指標會受生理狀態(tài)、測定方法和生活環(huán)境等諸多外界因素的影響，但是全血指標還是一種能客觀反映動物機體的生理機能及代謝狀況的重要指標，如有波動，則提示機體可能產(chǎn)生生理或病理變化[22]。本實驗結果表明，F(xiàn)M550的暴露并未對羅非魚的全血指標產(chǎn)生特異性改變，說明FM550的暴露對羅非魚的生理機能影響不大。

根據(jù)以上內容，可得出如下結論，在不同劑量的FM550暴露的56 d期間，各組間羅非魚的基礎生長數(shù)據(jù)并無顯著差異，但FM550的暴露可以改變羅非魚的甲狀腺激素水平，具體表現(xiàn)為高劑量的FM550暴露可以使羅非魚血清中的T3、FT3含量降低，T4、FT4含量升高，其具體機制還需進一步的研究。同時，F(xiàn)M550的暴露還可以導致羅非魚的脂代謝改變，具體變化為導致血清中TC、TG含量降低，HDL-C含量升高，LDL-C含量降低。此外，不同劑量的FM550暴露對羅非魚的全血生化指標并無影響。

致謝：感謝華南農業(yè)大學甘煉副教授在暴露實驗中給予的幫助。