于文波,王 慶**,魏 南，梁迪文，楊宇峰，崔宗斌

(1：暨南大學(xué)生態(tài)學(xué)系,廣州 510632) (2：中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所,武漢 430072)

目前鑒定浮游動(dòng)物休眠卵主要有傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定[9]和休眠卵萌發(fā)鑒定[10]兩種方法. 由于浮游動(dòng)物休眠卵分類(lèi)學(xué)資料的匱乏，以及休眠卵體表形態(tài)的多樣性，使得通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定浮游動(dòng)物休眠卵存在一定難度而且準(zhǔn)確率低，大多只能鑒定至屬或科. 休眠卵的生理結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，孵化成功與否取決于滯育終止的程度、卵的能量含量、非存活胚胎的數(shù)量以及環(huán)境因素，需要探索培養(yǎng)條件，萌發(fā)周期較長(zhǎng)，成功率低，鑒定結(jié)果也因分類(lèi)學(xué)知識(shí)的儲(chǔ)備差別巨大. 因此，通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定浮游動(dòng)物休眠卵存在一定難度而且準(zhǔn)確率低. 隨著DNA條形碼發(fā)展為一種可靠的物種快速鑒定工具，許多學(xué)者將其應(yīng)用至浮游動(dòng)物種類(lèi)鑒定中.

DNA條形碼技術(shù)是使用一段標(biāo)準(zhǔn)化的DNA片段進(jìn)行物種鑒定的方式，形似商品條形碼，建立DNA序列信息與物種信息逐一對(duì)應(yīng)的關(guān)系[11]. 針對(duì)不同類(lèi)群的生物，通常采用不同基因作為條形碼序列，例如生命條形碼聯(lián)盟(CBOL)植物工作組推薦葉綠體基因組的rbcL和matK片段作為植物鑒定的DNA條形碼[12]，真菌工作組推薦核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)基因(ITS)為真菌首選DNA條形碼[13]，而動(dòng)物物種的鑒定則采用線粒體細(xì)胞色素c氧化酶第一亞基編碼基因 (cytochromecoxidase I gene, COⅠ)[14]. COⅠ基因不僅廣泛應(yīng)用于鳥(niǎo)類(lèi)、蝴蝶、魚(yú)類(lèi)等物種鑒定中，而且由于使用DNA條形碼鑒定時(shí)不受生物生活史階段的限制，應(yīng)用至微型浮游動(dòng)物群落物種組成分析中發(fā)揮了巨大的作用，如王仁誠(chéng)等對(duì)膠州灣夏季浮游動(dòng)物物種組成的研究中，使用COⅠ基因成功鑒定出日本蟳、太平洋牡蠣等無(wú)脊椎動(dòng)物的浮游幼體[15]；張翔等使用COⅠ基因鑒定了太湖流域部分底棲無(wú)脊椎動(dòng)物種類(lèi)[16]；Machida等使用DNA條形碼技術(shù)，成功鑒定了密克羅尼西亞群島的多種浮游生物[17]；Bucklin等利用該方法，研究了北冰洋浮游橈足類(lèi)種類(lèi)組成[18]；Baek等使用線粒體細(xì)胞色素COⅠ基因?qū)?33種橈足類(lèi)個(gè)體成功進(jìn)行了鑒定[19]. 本研究采用DNA條形碼技術(shù)基于COⅠ基因序列對(duì)柳葉湖表層沉積物中浮游動(dòng)物休眠卵進(jìn)行了分子鑒定，同時(shí)對(duì)其形態(tài)信息進(jìn)行采集，對(duì)建立浮游動(dòng)物休眠卵圖鑒，快速鑒定休眠卵種類(lèi)有積極意義.

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域

柳葉湖(29°4′～29°8′N(xiāo)，111°40′～111°50′E)位于湖南省常德市境內(nèi)，屬于洞庭湖流域. 水域面積21.8 km2，容積為4.9×108m3，主要接納周邊山地、平原區(qū)地表徑流和溝港來(lái)水，與多條河匯合后入沅江，再匯入洞庭湖，是一個(gè)典型的城市淺水湖泊.

圖1 洞庭湖流域常德柳葉湖表層沉積物采樣點(diǎn)Fig.1 Sampling locations in Lake Liuye (Changde), Lake Dongting Basin, China

1.2 樣品采集與處理

根據(jù)湖泊形狀特征，共設(shè)8個(gè)采樣點(diǎn)(S1～S8，圖1)，2018年6月使用采泥器(12 cm × 24 cm)采集柳葉湖表層5 cm沉積物，每個(gè)樣點(diǎn)采集2個(gè)樣品，共采集16個(gè)樣品. 樣品采集后置于4℃冰箱保存，再帶回實(shí)驗(yàn)室后使用蔗糖浮選法[20]對(duì)休眠卵進(jìn)行分離. 具體步驟如下：取20 cm3沉積物樣品先后通過(guò)830 μm、64 μm篩網(wǎng)過(guò)濾初篩. 完成初篩后，瀝凈篩網(wǎng)中的水，用飽和蔗糖溶液(W蔗糖∶W水=1∶1)將濾渣轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，上下顛倒使其混勻，在3000 r/min下離心20 min. 離心后將上清液再次轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，重復(fù)上述步驟至上清液無(wú)雜質(zhì)，最后將上清液轉(zhuǎn)移至30 μm篩網(wǎng)，用超純水沖洗后轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，4℃保存.

1.3 休眠卵的圖像采集

將保存休眠卵的離心管輕輕上下顛倒，充分混勻后用吸管轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于體視顯微鏡下觀察，選擇卵體完整的休眠卵使用單通道移液器吸取到載玻片上，在光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS，BX51)下對(duì)共計(jì)191個(gè)休眠卵進(jìn)行圖像采集，測(cè)量長(zhǎng)短徑，觀察記錄形態(tài)特征，并對(duì)圖片進(jìn)行統(tǒng)一編號(hào)，隨后將單卵轉(zhuǎn)移到PCR管中，待提取DNA.

1.4 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

本研究采用“HotSHOT”法[21]對(duì)191個(gè)休眠卵進(jìn)行單卵DNA提取. 首先向含有浮游動(dòng)物休眠卵的PCR管中加入10 μL裂解液，在體式顯微鏡下用顯微鑷將卵體破碎，放置于干式恒溫儀95℃裂解30 min后取出，然后置于-20℃冷卻5 min，最后加入10 μL中和液并吸打混勻，即完成DNA提取.

使用引物ZplankF1_t1(TGTAAAACGACGGCCAGTTCTASWAATCATAARGATATT)和ZplankR1_t1(C￣A￣G￣G￣A￣A￣A￣C￣A￣G￣C￣T￣A￣T￣G￣A￣C￣T￣T￣C￣A￣G￣G￣R￣T￣G￣R￣C￣C￣R￣A￣A￣R￣A￣A￣T￣C￣A)對(duì)總基因組DNA的COⅠ基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增[16]，擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，包含2×Gflex PCR Buffer (Mg2+, dNTP plus) 12.5 μL，引物各0.3 μmol/L，模板為5 μL，Tks Gflex DNA Polymerase 0.5 μL，ddH2O 補(bǔ)足至25 μL. 擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性1 min，94℃變性40 s，45℃退火40 s，72℃延伸45 s，5個(gè)循環(huán)；94℃變性40 s，51℃退火40 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃ 5 min充分延伸. PCR完成后，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，選擇目標(biāo)條帶單一且明亮的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送交上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司純化并進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序引物為M13F(TGTAAAACGACGGCCAGT)及M13R(CAGGAAACAGCTATGAC).

1.5 序列分析與比對(duì)

將測(cè)序所得原始序列使用Chromas 2.6.4軟件對(duì)峰圖進(jìn)行檢查，并對(duì)堿基進(jìn)行逐一校對(duì). 由于樣品采用雙向測(cè)序，使用BioEdit 7.0.5軟件進(jìn)行序列拼接，以確保所用序列結(jié)果的準(zhǔn)確性. 對(duì)所獲得有效的序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information)進(jìn)行序列比對(duì)，同時(shí)下載相關(guān)的物種序列用于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建. 序列比對(duì)時(shí)，參考Machida等[17]和Bucklin等[23]的研究分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，若序列相似度大于96%，則可鑒定至物種；若序列相似性介于83%～96%間，依據(jù)相似度的高低鑒定至屬或科；若序列相似性小于83%，則歸類(lèi)至“門(mén)”或其他更高階元.

1.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

分別對(duì)橈足類(lèi)、枝角類(lèi)和輪蟲(chóng)3個(gè)類(lèi)群物種序列開(kāi)展系統(tǒng)發(fā)育分析. 使用MEGA X(10.0.5)分析所獲得序列長(zhǎng)度、堿基組成，采用 Kimura-2-Parameter雙參數(shù)模型(K2P)計(jì)算遺傳距離，使用鄰接(Neighbor-Joining)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，經(jīng)1000次重復(fù)抽樣(bootstrap)檢驗(yàn)其置信度. 根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果，選取每條序列相似度最高的序列作為參考序列，同時(shí)下載與比對(duì)結(jié)果相似度相近物種的序列及同源序列，其中橈足類(lèi)47條、枝角類(lèi)54條，輪蟲(chóng)38條序列分別構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)一步確定物種.

如圖9(b)所示,新型擴(kuò)孔鉆頭領(lǐng)眼段出現(xiàn)嚴(yán)重失效,主要有兩方面的原因：其一，地層不均質(zhì)性強(qiáng)，地層礫石含量高，鉆頭承受了較高沖擊載荷，鉆頭心部布齒密度較低，個(gè)別切削齒失效從而導(dǎo)致鉆頭心部區(qū)域失效現(xiàn)象迅速發(fā)生；其二，擴(kuò)孔鉆頭的橫向不平衡力仍然存在，為了平衡這一鉆頭載荷所產(chǎn)生的側(cè)彎矩，鉆頭回轉(zhuǎn)中心與理想幾何中心會(huì)產(chǎn)生一個(gè)偏轉(zhuǎn)角度(如圖10所示)，這一偏轉(zhuǎn)角度會(huì)使鉆頭心部切削齒產(chǎn)生額外的吃入深度Δh，其切削載荷大幅升高，最終導(dǎo)致鉆頭心部切削齒快速磨損。

2 結(jié)果

2.1 柳葉湖浮游動(dòng)物休眠卵序列特征及比對(duì)結(jié)果

本研究共對(duì)191個(gè)休眠卵進(jìn)行了分子鑒定，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接后成功獲取101條COⅠ基因部分片段序列，單次成功率為52.88%. 擴(kuò)增的COⅠ基因部分序列長(zhǎng)度約為649 bp，序列無(wú)插入和缺失. 在所有序列比對(duì)結(jié)果中核苷酸T、C、A、G的平均含量分別為35.22%、17.78%、27.91%、18.98%，且A+T含量(63.13%)遠(yuǎn)高于C+G含量(36.76%)，堿基均出現(xiàn)明顯的偏倚性，符合線粒體堿基組成特點(diǎn). 常德柳葉湖浮游動(dòng)物休眠卵獲得的DNA序列比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表1. 本研究在191個(gè)休眠卵中所獲得101條序列中，成功鑒定出17種休眠卵，其中11種鑒定至種，5種鑒定至屬，1種鑒定至科；同時(shí)對(duì)成功鑒定的休眠卵進(jìn)行分類(lèi)并逐個(gè)編號(hào)，其中橈足類(lèi)為CP1、枝角類(lèi)為C1～C13、輪蟲(chóng)為Ro1～Ro3，同時(shí)記錄該種休眠卵出現(xiàn)的樣點(diǎn)及檢出的個(gè)體數(shù)(表1、圖2).

表1 條形碼序列NCBI比對(duì)結(jié)果與樣品鑒定結(jié)果的比較1)

1)單次成功率依次為：橈足類(lèi):47%；枝角類(lèi):57%；輪蟲(chóng)類(lèi):39%.

圖2 休眠卵形態(tài)學(xué)信息Fig.2 Morphological information of resting eggs

樣品C1、C2、C4、C6、C12、C13、CP1、Ro1、Ro2通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)可鑒定至種(表1)；樣品C3、C5、C9、Ro3可鑒定至屬(表1)；樣品C7和C8鑒定至科，其中樣品C8可能為高殼溞(Kurziasp.，序列相似度為82%)；樣品C10序列比對(duì)結(jié)果有兩種，無(wú)刺大尾溞(Leydigiaacanthocercoides)和Camptocercusdadayi，相似度分別為85.9%和85.8%，同屬盤(pán)腸溞科；樣品C11比對(duì)結(jié)果為低額溞(Simocephalussp.)，可能為黑龍江低額溞(S.heilongjiangensis，相似度88.5%).

圖3 基于鄰接法構(gòu)建的橈足類(lèi)休眠卵COⅠ基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Neighbor-Joining tree resulting from analysis of COⅠ gene data of copepod resting eggs

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

本研究涉及3個(gè)類(lèi)群，分別基于49個(gè)、69個(gè)、48個(gè)單倍型構(gòu)建3條系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3～5)，其中橈足類(lèi)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中鑒定序列為2條，下載相關(guān)同源序列為47條；枝角類(lèi)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中鑒定序列為15條，下載相關(guān)序列為54條；輪蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中鑒定序列為9條，下載相關(guān)序列為38條. 觀察構(gòu)建的Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示柳葉湖浮游動(dòng)物不同種類(lèi)休眠卵間的界限明顯，置信度較高(99%～100%)(圖3～5). 同屬物種均可聚類(lèi)為一支，如：細(xì)巧華哲水蚤(Sinocalanustenellus)先于參比序列(HM045324.1、HM045326.1)聚為一支后與同屬的中華華哲水蚤(S.sinensis)聚為一支，微型裸腹溞(Moinamicrura)首先與其參比序列(LC215484.1)聚為一支后與同屬的遠(yuǎn)東裸腹溞(M.weismanni)聚為一支；萼花臂尾輪蟲(chóng)(Brachionuscalyciflorus)先與其參比序列(GU232718.1、GU232722.1)獨(dú)立聚為一支，后與同屬的裂足臂尾輪蟲(chóng)(B.diversicornis)聚為一支. 序列比對(duì)相似度較低的休眠卵C10、C11分別與無(wú)刺大尾溞和黑龍江低額溞的參比序列聚類(lèi)至一起，可確定為相同物種.

圖4 基于鄰接法構(gòu)建的枝角類(lèi)休眠卵COⅠ基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Neighbor-Joining tree resulting from analysis of COⅠ gene data of cladocera resting eggs

3 討論

3.1 使用DNA條形碼技術(shù)鑒定休眠卵的可行性及局限性

由于休眠卵傳統(tǒng)鑒定較為困難，本研究用DNA條形碼技術(shù)對(duì)柳葉湖表層沉積物中休眠卵種類(lèi)進(jìn)行初步鑒定，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，在物種水平上準(zhǔn)確鑒定柳葉湖浮游動(dòng)物休眠卵11種，構(gòu)建了Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)所有物種均聚為獨(dú)立分支，以屬為分類(lèi)階元亦可在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中成功聚類(lèi)，表明DNA條形碼技術(shù)可成功應(yīng)用于柳葉湖浮游動(dòng)物休眠卵的種類(lèi)鑒定. 研究過(guò)程中鑒定出許多其他物種的休眠卵或休眠體，如斑條透明苔蟲(chóng)(Hyalinellapunctata)、平角渦蟲(chóng)(Planocerareticulata)、長(zhǎng)跗搖蚊(Tanytarsussp.)等，同時(shí)所測(cè)序列中未鑒定出原生動(dòng)物.

該技術(shù)也存在一定局限性，例如本研究中只鑒定出一種橈足類(lèi)休眠卵，原因可能是橈足類(lèi)休眠卵個(gè)體小，形態(tài)種類(lèi)多變，在體式顯微鏡下挑選單個(gè)體休眠卵進(jìn)行分子鑒定時(shí)易與雜質(zhì)混淆，造成鑒定遺漏. 另外輪蟲(chóng)種類(lèi)休眠卵差異細(xì)微，無(wú)特殊形態(tài)特征，在對(duì)本研究中所挑選的未知休眠卵進(jìn)行分子鑒定時(shí)，鑒定結(jié)果大多為萼花臂尾輪蟲(chóng)，其他種數(shù)量較少. 除部分浮游動(dòng)物休眠卵體形易區(qū)分外，大部分休眠卵與沉積物顆?；螂s質(zhì)相似，顯微鏡下不容易挑取.

3.2 研究中出現(xiàn)的問(wèn)題與改進(jìn)

首先，本研究休眠卵單次鑒定成功率約為52.88%. 鏡檢下許多有正常卵胚胎結(jié)構(gòu)的完整卵體，由于產(chǎn)物濃度不達(dá)標(biāo)、無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物或PCR產(chǎn)物為假陽(yáng)性，從而導(dǎo)致在后期PCR過(guò)程中鑒定失敗. 究其原因，可能主要是個(gè)別物種COⅠ序列與引物某些位點(diǎn)不契合致使成功率偏低，因此有學(xué)者改進(jìn)設(shè)計(jì)了兼并引物jgLCO1490/jgHCO2198[24]或針對(duì)某些特定種群設(shè)計(jì)巢式PCR引物[25]；卵體處于不應(yīng)期內(nèi)，代謝速率較低，胚胎內(nèi)線粒體較少，無(wú)法提取到足夠的線粒體DNA；卵體表面攜帶大量病毒、細(xì)菌等[26-27]，干擾COⅠ基因的特異性擴(kuò)增，導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物主要為細(xì)菌DNA，從而表現(xiàn)為假陽(yáng)性. 因此，當(dāng)破碎枝角類(lèi)的卵時(shí)應(yīng)當(dāng)將卵鞍剔除，以防止其攜帶的細(xì)菌或病毒對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響，或?qū)τ趥€(gè)體較大休眠卵DNA提取時(shí)可以采用“玻璃乳提取法”[28]，以提高DNA提取的純度及成功率. 不同樣點(diǎn)休眠卵鑒定成功率不同，靠近湖心的樣點(diǎn)成功率較高(50%～60%)，而近岸的樣點(diǎn)成功率較低(20%～30%). 可能是由于近岸表層沉積物中休眠卵受到某些環(huán)境因子影響使DNA受到降解，降低卵體DNA質(zhì)量，例如Jiang等研究證實(shí)沉積物中的重金屬含量會(huì)使太平洋紡錘水蚤(Acartiapacifica)休眠卵萌發(fā)率顯著降低[29]，并且表層沉積物中石油烴含量的增加會(huì)使太平洋紡錘水蚤休眠卵的存活率下降[30].

此外，若出現(xiàn)無(wú)法比對(duì)到具體物種的序列，可通過(guò)進(jìn)一步系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析確定結(jié)果，如休眠卵C10、C11樣品，樣品通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析分別與無(wú)刺大尾溞和黑龍江低額溞聚類(lèi)至一支，可初步確定為相同物種. 本研究中休眠卵C3、C5、C9、Ro3樣品鑒定至屬，C7、C8僅能鑒定至科，并且研究中所獲取多條序列在數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)中無(wú)相關(guān)信息返回，原因主要是NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中無(wú)相似度高的參比序列，因而無(wú)法進(jìn)行比對(duì). 由于目前傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定仍是浮游動(dòng)物鑒定的主要手段，但從事傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的專(zhuān)家較少，鑒定主觀性較強(qiáng). 若將形態(tài)學(xué)鑒定和DNA條形碼相結(jié)合，即在分類(lèi)學(xué)專(zhuān)家?guī)椭?，建立本地DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，這必將極大地提升物種鑒定、群落動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的準(zhǔn)確性[31-33].

目前國(guó)內(nèi)針對(duì)浮游動(dòng)物休眠卵鑒定工作開(kāi)展較少，往往都是通過(guò)單一方式鑒定. 不同鑒定方式有不同的優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)當(dāng)將多種方式結(jié)合起來(lái)準(zhǔn)確鑒定浮游動(dòng)物休眠卵，以建立較完整的浮游動(dòng)物休眠卵鑒定圖庫(kù)，方便進(jìn)一步開(kāi)展休眠卵研究工作. 此外NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中浮游動(dòng)物信息不夠完善，在保證精確度的同時(shí)，應(yīng)加大對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的上傳力度. 隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步和DNA條形碼技術(shù)的普及，我們相信DNA條形碼技術(shù)將在物種鑒定中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用.

4 結(jié)論

本研究采用DNA條形碼技術(shù)對(duì)柳葉湖表層沉積物休眠卵種類(lèi)進(jìn)行鑒定，成功獲取17種物種信息，初步建立了柳葉湖浮游動(dòng)物休眠卵圖譜. 在目前休眠卵傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類(lèi)資料匱乏的情況下，COⅠ基因可作為浮游動(dòng)物休眠卵鑒定的一種可靠、快捷、有效的方式. 但NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)于物種的收錄依舊不夠完整和準(zhǔn)確，導(dǎo)致本研究個(gè)別樣品無(wú)法鑒定至種. 因此，比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)準(zhǔn)確性和完整性亟待加強(qiáng)完善.

致謝: 感謝曾悅和劉陳在論文寫(xiě)作中給予的幫助.