王 威，富瑩雪，陳 璟，甘嘯陽，許惠琴，喻 斌，呂高虹，盧金福

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210023)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見且危險(xiǎn)的并發(fā)癥，以炎癥、腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張、彌漫性腎小球基底膜增厚、間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮為主要特征，DN已被認(rèn)為是終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)的主要原因，晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)在DN的發(fā)生和發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用。隨著近年來的深入研究，發(fā)現(xiàn)AGEs在DN炎性損傷中扮演重要角色[1]，其中巨噬細(xì)胞是介導(dǎo)DN炎性腎損傷的關(guān)鍵炎性細(xì)胞。巨噬細(xì)胞廣泛分布在機(jī)體的各個(gè)器官和組織中，被稱為單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，主要參與免疫、炎性反應(yīng)及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持，AGEs可以刺激巨噬細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)，TNF-α可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并且對(duì)腎小球系膜細(xì)胞和腎小管細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，導(dǎo)致直接腎損傷[2]。研究表明，巨噬細(xì)胞在腎臟中的積聚與DN血肌酐、蛋白尿和間質(zhì)纖維化水平呈正相關(guān)，與腎功能呈負(fù)相關(guān)；巨噬細(xì)胞浸潤也與糖尿病動(dòng)物高血糖水平、腎小球免疫復(fù)合物沉積及進(jìn)行性纖維化、趨化因子增加密切相關(guān)[3]。

梓醇(catalpol)是一種從生地黃中提取出來的環(huán)烯醚萜苷類化合物，研究表明，梓醇可以改善db/db糖尿病小鼠尿多且渾濁的狀況，恢復(fù)其受損腎功能，減輕腎臟病理變化，減輕腎小球系膜細(xì)胞外基質(zhì)沉積，其機(jī)制與AGEs/RAGE/Sphk1信號(hào)通路的抑制有關(guān)[4]。梓醇能夠抑制AGEs誘導(dǎo)的單核細(xì)胞炎癥因子分泌，通過抑制細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平、核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor kappa-B，NF-κB)的轉(zhuǎn)位，從而抑制AGEs介導(dǎo)的炎癥[5]。有研究發(fā)現(xiàn)單核巨噬細(xì)胞和腎小球系膜細(xì)胞共培養(yǎng)，AGEs上調(diào)不規(guī)則趨化因子(fractalkine，F(xiàn)kn)降低系膜細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的積聚且提高單核細(xì)胞的遷移從而加劇DN[6]。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用體外巨噬細(xì)胞與系膜細(xì)胞共培養(yǎng)模型，探究梓醇干預(yù)AGEs刺激巨噬細(xì)胞對(duì)腎系膜細(xì)胞損傷的作用，為減輕糖尿病腎病炎性損傷提供理論研究依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與材料小鼠腎系膜細(xì)胞(MMCs)從中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫購入；小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。梓醇(catalpol)標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC≥98%)，成都瑞芬思生物科技有限公司，批號(hào)：Z-005-180315；氨基胍(aminoguanidine)、MTT，Sigma公司，批號(hào)：079K1734V、MKBN7264V；DMEM/F-12 1 ∶1(1×)細(xì)胞培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清，美國Gibco公司；RIPA組織/細(xì)胞裂解液、DAPI染液、Triton X-100、山羊血清，Solarbio科技有限公司，批號(hào)：R0020、20190315、T8200、408J051；通用型組織固定液，武漢谷歌生物科技有限公司，批號(hào)：163618；FN、COL-Ⅳ、TGF-β抗體，英國Abcam公司；β-actin，Bioworld公司；Anti-rabbit IgG，美國CST公司；FITC-羊抗兔IgG，BOSTER生物工程有限公司，批號(hào)：BST13K28C05；小鼠白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素-12(interleukin-12，IL-12)、TNF-α ELISA試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)：201902。

1.2 儀器Synergy HT酶標(biāo)儀，美國Bio-Tek公司；電泳儀，美國BIO-RAD公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，日本SANYO公司；冷凍離心機(jī)，美國BECKMAN公司；化學(xué)發(fā)光成像儀，美國GE公司；Ti型倒置熒光顯微鏡，日本Nikon公司；Transwell 3450、3413共培養(yǎng)板，美國Corning公司。

2 方法

2.1 AGEs的制備稱取適量的牛血清白蛋白(BSA)溶于PBS中，配制成濃度為50 g·L-1的溶液，再與0.5 mol·L-1的葡萄糖溶于0.2 mol·L-1PBS(pH 7.4)中。待溶解后，37 ℃避光孵育4個(gè)月，使其形成AGEs-BSA(即AGEs)。在平行條件下配制不含葡萄糖的上述BSA溶液，制備0-BSA(無糖基化BSA)溶液作為對(duì)照。4個(gè)月后，使用孔徑為分子量1萬的透析袋，置于10 mmol·L-1PBS(pH 7.4)中,4 ℃透析24 h，以除去未完全反應(yīng)的葡萄糖。制備好的AGEs用0.22 μm濾器過濾除菌，-20 ℃保存?zhèn)溆茫?jīng)BCA蛋白定量測濃度為22.6 g·L-1。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)小鼠系膜細(xì)胞(MMCs)和小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)培養(yǎng)于含1g·L-1胎牛血清和0.1g·L-1青霉素-鏈霉素DMEM/F12培養(yǎng)基中，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 MTT法檢測系膜細(xì)胞增殖取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7以1×108·L-1每孔1 mL接種于24孔板內(nèi)，另取MMCs以5×107·L-1每孔0.5 mL接種于0.4 μm的Transwell小室，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。當(dāng)細(xì)胞貼壁時(shí)，24孔板和Transwell小室換無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h，依次分為空白對(duì)照組、模型組、氨基胍組(終濃度10.0 μmol·L-1)、梓醇組(終濃度0.1、1.0、10.0 μmol·L-1)，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，各組加藥培養(yǎng)1 h后，下層加入終濃度100 mg·L-1的 AGEs刺激RAW264.7，將Transwell小室移至24孔板上方共培養(yǎng)23 h。從孵箱中拿出共培養(yǎng)板舍去上層小室內(nèi)培養(yǎng)液，MTT法測定吸光度值(490 nm)，并計(jì)算細(xì)胞增殖率。

細(xì)胞增殖率/%=[(ODx-ODControl)/ODControl]×100%

2.4 免疫熒光法檢測腎系膜細(xì)胞表達(dá)COL-Ⅳ熒光強(qiáng)度將細(xì)胞爬片置于Transwell小室，取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7以1×108·L-1每孔2 mL接種于6孔板內(nèi)，另取MMCs以2×108·L-1每孔0.5 mL接種于0.4 μm小室爬片。分組與給藥處理按“2.3”項(xiàng)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。冰PBS小心沖洗爬片3次，固定液固定15 min，用PBS稀釋的Triton X-100通透20 min，加入PBS配制山羊血清封閉1 h，每片加0.2 mL COL-Ⅳ一抗4 ℃過夜。d 2每片爬片加入PBS稀釋的0.2 mL FITC-羊抗兔IgG孵育2 h，PBS洗3次，滴加DAPI染液，5 min后PBS洗4遍吸去爬片液體后上機(jī)檢測，使用Image Pro Plus 6軟件統(tǒng)計(jì)分析。

2.5 Western blot法檢測腎系膜細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)取對(duì)數(shù)生長期RAW264.7以1×108·L-1每孔2 mL接種于6孔板內(nèi)，另外取對(duì)數(shù)生長期MMCs以2×108·L-1每孔2 mL接種于0.4 μm的Transwell小室。分組與給藥處理同“2.3”項(xiàng)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。吸除小室內(nèi)液體，用不含EDTA的胰酶將MMCs吹打混懸于小室中并離心收集，加入裂解液提蛋白，并測定蛋白濃度。蛋白樣品按體積加上樣緩沖液，95 ℃煮5 min后，進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，加入0.5 g·L-1BSA封閉液，室溫2 h后加入一抗4 ℃過夜。d2 PBST洗3次，加入HRP二抗，室溫2 h后ECL顯色。利用Image J軟件分析各組灰度值β-actin為內(nèi)參計(jì)算FN、COL-Ⅳ、TGF-β蛋白表達(dá)量。

2.6 ELISA法檢測巨噬細(xì)胞上清液中IL-6、IL-12、TNF-α的分泌取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7以1×108·L-1每孔1 mL接種于24孔板內(nèi)，另取MMCs以5×107·L-1，每孔0.5 mL接種于0.4 μm的Transwell小室，分組與給藥處理同“2.3”項(xiàng)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。拿出共培養(yǎng)板，吸出下層巨噬細(xì)胞上清液，按說明書檢測上清中IL-6、IL-12、TNF-α水平。

3 結(jié)果

3.1 梓醇對(duì)AGEs刺激巨噬細(xì)胞介導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖的影響與空白對(duì)照組相比，AGEs刺激巨噬細(xì)胞介導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖率升高(P<0.01)，而梓醇(0.1、1.0、10.0 μmol·L-1)、氨基胍(10.0 μmol·L-1)可不同程度的抑制由AGEs刺激巨噬細(xì)胞介導(dǎo)系膜引起的細(xì)胞增殖(P<0.05，P<0.01)(Tab 1)。

Fig 1 Effect of catalpol on fluorescent expression of COL-IV in MMCs mediated by AGEs-stimulated RAW264.7

Tab 1 Effect of catalpol on proliferation rate in MMCs mediated by AGEs-stimulated RAW264.7

3.2 梓醇對(duì)AGEs刺激巨噬細(xì)胞介導(dǎo)系膜細(xì)胞表達(dá)COL-Ⅳ熒光強(qiáng)度的影響免疫熒光結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，AGEs刺激巨噬細(xì)胞介導(dǎo)系膜細(xì)胞COL-Ⅳ(Fig 1)蛋白熒光明顯增強(qiáng)(P<0.01)，而加入梓醇(10.0 μmol·L-1)、氨基胍(10.0 μmol·L-1)干預(yù)后COL-Ⅳ蛋白熒光減弱(P<0.01)。

3.3 梓醇對(duì)AGEs刺激巨噬細(xì)胞介導(dǎo)系膜細(xì)胞FN、COL-Ⅳ、TGF-β蛋白表達(dá)的影響與空白對(duì)照組相比，AGEs刺激巨噬細(xì)胞介導(dǎo)系膜細(xì)胞FN、COL-Ⅳ、TGF-β(Fig 2)蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，而梓醇(0.1、1.0、10.0 μmol·L-1)、氨基胍(10.0 μmol·L-1)可不同程度的下調(diào)其表達(dá)(P<0.05，P<0.01)，且梓醇的下調(diào)程度與濃度相關(guān)。

3.4 梓醇對(duì)AGEs刺激巨噬細(xì)胞分泌IL-6、IL-12、TNF-α的影響與空白對(duì)照組相比，AGEs可明顯提高巨噬細(xì)胞IL-6、IL-12、TNF-α分泌水平(P<0.01)，而梓醇(0.1、1.0、10.0 μmol·L-1)、氨基胍(10.0 μmol·L-1)可不同程度的抑制其分泌(P<0.05，P<0.01)，且梓醇的抑制程度與濃度相關(guān)(Tab 2、Tab 3、Tab 4)。

Fig 2 Effect of catalpolon expression of FN,COL-Ⅳ and TGF-β in MMCs mediated by AGEs-stimulated

Tab 2 Effect of catalpol on levels of IL-6 in RAW264.7 macrophages induced by

Tab 3 Effect of catalpol on levels of IL-12 in RAW264.7 macrophages induced by

Tab 4 Effect of catalpol on levels of TNF-α in RAW264.7

4 討論

DN是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，研究表明腎臟疾病的發(fā)展與巨噬細(xì)胞在腎組織中的遷移、浸潤、炎癥介質(zhì)的高表達(dá)密切相關(guān)，并且可能是各種機(jī)制下游的共同環(huán)節(jié)[7]。

高血糖是DN炎癥發(fā)病機(jī)制的主要始動(dòng)因素，長期高血糖導(dǎo)致AGEs在體內(nèi)過多蓄積，一方面刺激巨噬細(xì)胞，通過分泌炎癥因子如IL-6、IL-12、TNF-α和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)等促進(jìn)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腎固有細(xì)胞損傷，如腎小球系膜細(xì)胞增生、血管內(nèi)皮細(xì)胞泡沫化和足細(xì)胞凋亡[8-9]；另一方面在糖尿病環(huán)境下，AGEs刺激腎系膜細(xì)胞，使其分泌單核細(xì)胞趨化蛋白(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)等反過來激活、促進(jìn)巨噬細(xì)胞從血液向腎臟富集并分泌大量炎癥因子加重腎系膜細(xì)胞的損傷，擴(kuò)大炎癥加快DN的發(fā)展[10-11]。

研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)是纖維化最關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子和纖維化的早期生物標(biāo)志物，高血糖和炎癥可以刺激TGF-β的活性，被激活的TGF-β通過促進(jìn)多種分子如纖維粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、Ⅳ型膠原(Collage TypeⅣ，COL-Ⅳ)的分泌加速DN中的腎纖維化進(jìn)程，進(jìn)而加重DN[12]。研究結(jié)果表明[13]，TGF-β激活激酶-1( TGF-β activated kinase-1，TAK1) 抑制劑可通過 TAK1 /MAPKs、MAPKs /NF-κB途徑抑制AGEs對(duì)巨噬細(xì)胞的激活和炎癥因子的表達(dá)。此外，腎小球系膜細(xì)胞分泌的FN、COL-Ⅳ等細(xì)胞外基質(zhì)又可與AGEs形成交叉連接或通過與晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor of advanced glycation endproducts，RAGE)結(jié)合來影響DN的病理過程[14]，F(xiàn)N也可通過促進(jìn)粘著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)和Src家族激酶(Src family kinase，SFK)活化從而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞遷移。研究表明，芳基烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AhR)可通過氧化應(yīng)激級(jí)聯(lián)調(diào)控環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE 2)表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)沉積參與Nε-羧甲基賴氨酸(Nε-carboxymethyllysine，CML一種主要的晚期糖基化終產(chǎn)物)誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞激活和巨噬細(xì)胞浸潤[15]。

本實(shí)驗(yàn)建立了AGEs刺激巨噬細(xì)胞與腎系膜細(xì)胞共培養(yǎng)模型，AGEs刺激巨噬細(xì)胞后，其炎癥因子IL-6、IL-12、TNF-α分泌水平升高，與此同時(shí)腎系膜細(xì)胞FN、COL-Ⅳ、TGF-β蛋白表達(dá)水平升高，而加入梓醇再用AGEs刺激巨噬細(xì)胞后可下調(diào)其炎癥因子及系膜細(xì)胞蛋白表達(dá)水平，這提示梓醇可通過下調(diào)巨噬細(xì)胞炎癥因子水平緩解其對(duì)系膜細(xì)胞造成的損傷，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)于江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝實(shí)驗(yàn)室老師的指導(dǎo)和同學(xué)們的幫助。)