張文文，唐 娜，孫瑞霞，鐘 華，何 芳

(1.新疆石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，新疆 石河子 832002；2. 新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832002)

高血壓是全球范圍內(nèi)影響人類健康最常見(jiàn)的心腦血管病之一，已成為目前重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題。其患病率居高不下，且呈持續(xù)上升的趨勢(shì)[1]，目前我國(guó)高血壓控制現(xiàn)狀低于發(fā)達(dá)國(guó)家，因此，我國(guó)高血壓防治任重而道遠(yuǎn)。

已知長(zhǎng)期過(guò)高的血壓導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙，而血管內(nèi)皮功能障礙與心腦血管疾病也緊密相關(guān)，是其發(fā)生發(fā)展的病變基礎(chǔ)，因此改善血管內(nèi)皮功能已成為心腦血管疾病治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)[2]。

目前，關(guān)于微血管測(cè)量技術(shù)在疾病研究中應(yīng)用的報(bào)道逐年增多，但是由于該技術(shù)操作步驟復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，限制了該技術(shù)在國(guó)內(nèi)的應(yīng)用普及[3]。尤其對(duì)于血管內(nèi)皮功能障礙的研究，國(guó)內(nèi)尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)；已有關(guān)于血管內(nèi)皮去除方式的研究，存在大小動(dòng)脈相互混淆的現(xiàn)象，并不完全適用于所有微動(dòng)脈的研究。而筆者對(duì)微血管壓力肌動(dòng)血管內(nèi)皮的去除所作的研究匯報(bào)，有助于血管內(nèi)皮去除的標(biāo)準(zhǔn)化，提高微血管測(cè)量技術(shù)研究數(shù)據(jù)的可信度。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物12周齡 ♂ ，體質(zhì)量(200～250)g，自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertensive rats，SHR)和正常血壓大鼠(Wistar-Kyoto rats，WKY)，每組各6只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(動(dòng)物合格許可證編號(hào)SCXK(京)2007-0001)，符合SPF清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。飼養(yǎng)條件：溫度(20±2) ℃、濕度(48±2)%。大鼠分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)期間，大鼠自主飲食，自由飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)均在符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求下進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及配制苯腎上腺素(phenylephrine，PE，批號(hào)：LRAA9501)、硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP，批號(hào)：LRAA2556)、吲哚美辛(indomethacin，批號(hào)：WXBC4210V)、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA，批號(hào)：0915S04)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；乙酰膽堿(acetylcholine，ACh，批號(hào)：BCBR3675V)購(gòu)自美國(guó)APexbio公司；L-NAME(批號(hào)：S287702)購(gòu)自美國(guó)Selleck公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

溶液配制：生理鹽溶液(physiologic saltsolution, PSS)成分(mmol·L-1)：NaCl 118.9， KCl 4.69，MgSO4·7H2O 1.17，KH2PO41.18，CaCl22.5， NaHCO325，EDTA 0.026，G 5.5。高鉀外液(high potassium physiological salt solution，KPSS，相當(dāng)于60 mmol·L-1KCl)成分(mmol·L-1)：KCl 123. 70，MgSO4·7H2O 1. 17，KH2PO41. 18，CaCl22. 5，NaHCO325，EDTA 0.026，G 5.5。充分搖勻溶解后，充入混合氣體(95%O2+5%CO2)，氧飽和10～15 min，時(shí)間過(guò)久易致液體中氣體過(guò)多，最后粘附于血管上，pH調(diào)節(jié)至7.40后使用。所配置的液體均放置在冰箱(4 ℃)中保存，使用前充分搖勻。

1.3 儀器壓力肌動(dòng)圖系統(tǒng)(DMT，110P型)(丹麥Denmark公司)、倒置相差顯微鏡(美國(guó)Olympus公司)、光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)、P-97微電極拉制儀(美國(guó)Sutter公司)、微型負(fù)壓吸引器(GL-802型)(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司)、撕囊鑷和角膜剪(蘇州六六視覺(jué)科技有限公司)、Dumont鑷子(意大利)等。

2 方法

2.1 大鼠血壓測(cè)量使用BP-6鼠尾無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量?jī)x檢測(cè)大鼠清醒安靜狀態(tài)下尾動(dòng)脈血壓，每只不少于3次，結(jié)果取平均值。

2.2 標(biāo)本制備大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉 40 mg·kg-1，待動(dòng)物麻醉后斷頭處死，迅速取出腸管，注意：誤用力牽拉腸管，置于4 ℃、氧飽和的PSS液中。在裝有固定膠的培養(yǎng)皿中固定標(biāo)本，注意：固定時(shí)不宜過(guò)度牽拉。在顯微鏡下仔細(xì)分離2級(jí)腸系膜動(dòng)脈血管分支，注意區(qū)分動(dòng)靜脈(動(dòng)脈細(xì)、圓，彈性好，色淺；靜脈扁、寬，彈性差，色深)。仔細(xì)清除動(dòng)脈周?chē)?、結(jié)締組織，注意手法一定要輕柔，勿用力牽拉血管，碰觸血管，避免損傷血管內(nèi)皮，降低血管活性。剪取無(wú)分支的血管段(長(zhǎng)度2～3 mm)備用。

2.3 血管套接及血管內(nèi)皮去除(Fig 1) 首先，排空微電極兩端的氣體，將血管一端套接在玻璃微電極上(直徑約50 μm)，注意誤碰及玻璃微電極尖端，防止電極斷裂或電極玻璃碎渣進(jìn)入血管，平衡升壓階段，隨壓力升高，液體流動(dòng)，劃破血管，致數(shù)據(jù)不準(zhǔn)或?qū)嶒?yàn)失敗。用10-0眼科尼龍線固定血管。用裝有過(guò)濾PSS液注射器緩慢沖走血管內(nèi)的殘留物，注意手法要輕，誤用力過(guò)猛，損傷血管內(nèi)皮。而微血管內(nèi)皮去除，國(guó)內(nèi)目前尚未見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)的方法。本研究方法其實(shí)施步驟如下：對(duì)于去除內(nèi)皮的血管環(huán)，用撕囊鑷夾取血管的無(wú)需測(cè)量部分，將血管?chē)@電極尖端輕輕旋轉(zhuǎn)1圈[4]，破壞血管內(nèi)皮的完整性，注意：手法要輕，誤刺穿血管。然后血管一端套接完成后，用注射器向血管內(nèi)推注氣體，再次破壞血管內(nèi)皮完整性。之后用裝有過(guò)濾PSS液的注射器緩慢沖洗血管，以相同的方法套接血管的另一端。給予血管活性藥物之前，先給予吲哚美辛(環(huán)氧合酶抑制劑)、L-NAME(NO合酶抑制劑)共同預(yù)孵育血管20 min，且其持續(xù)存在于整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程[5]。將血管固定好的灌流槽迅速轉(zhuǎn)移至倒置顯微鏡臺(tái)上，開(kāi)啟光學(xué)顯微鏡，調(diào)整放大倍數(shù)為10 (物鏡)×10 (目鏡)。將與電極兩端相連的玻璃瓶蓋用力旋緊，使其形成一個(gè)密封系統(tǒng)。接著進(jìn)行管路氣體的排除，用裝有5 ml過(guò)濾PSS液的注射器將P1端管路里的氣體排至裝有過(guò)濾PSS液(100 mL)的玻璃瓶中，P2端管路里氣體排至廢液瓶中，整體形成一個(gè)液封狀態(tài)，確保整個(gè)循環(huán)中無(wú)殘留氣體，以防氣體流動(dòng)至血管腔中，造成血管損傷。操作期間注意手法要輕緩，步驟要清晰，以免損壞壓力換能器。在恒溫(37 ℃)的水浴槽中持續(xù)恒速通以(95% O2和5% CO2)混合氣體。

Fig 1 Vascular socket and endothelial removal in water bath of pressure motor system

2.4 壓力平衡及血管活性檢測(cè)初始平衡階段保持液體流動(dòng)，參數(shù)設(shè)定(首先開(kāi)啟壓力、溫度，P1端20 mmHg，P2端5 mmHg)，以便沖走血管內(nèi)的殘留物，平衡持續(xù)時(shí)間約為3 min；然后調(diào)整參數(shù)(P2端上調(diào)至20 mmHg，時(shí)間 5 min，之后以10 mmHg為一個(gè)梯度，每個(gè)梯度穩(wěn)定5 min，使管腔內(nèi)壓力逐漸升至60 mmHg穩(wěn)定)；之后血管在60 mmHg穩(wěn)定孵育1 h，平衡孵育期間每20 min更換1次水浴槽內(nèi)的PSS液體。平衡穩(wěn)定1 h后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)。先用血管收縮劑KCl(60 mol·L-1)收縮血管，激發(fā)最大血管活性，收縮平穩(wěn)后，用內(nèi)皮依賴性血管舒張劑ACh (10-5mol·L-1)舒張血管——舒張幅度大于70%～80%可認(rèn)為內(nèi)皮完整，小于10%則認(rèn)為血管內(nèi)皮去除。之后用PSS液連續(xù)沖洗3次，再次平衡穩(wěn)定20 min后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

2.5 記錄藥物對(duì)血管舒縮活動(dòng)的影響檢測(cè)血管符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)后，正式開(kāi)始實(shí)驗(yàn)時(shí)，打開(kāi)負(fù)壓吸引器(給藥期間負(fù)壓吸引器處于持續(xù)開(kāi)啟狀態(tài))，水浴槽內(nèi)的PSS液控制在5 mL，采取累積給藥法依次加入不同濃度PE、ACh和/或SNP (10-9mol·L-1，10-8mol·L-1，10-7mol·L-1，10-6mol·L-1，10-5mol·L-1和10-4mol·L-1)，在血管反應(yīng)達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)后，依次逐漸加入高一級(jí)別濃度的藥物，分別觀察并記錄該藥物對(duì)血管直徑的作用。用Myoview軟件控制血管內(nèi)壓力并記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果

3.1 大鼠血壓值比較如Fig 2所示，與WKY大鼠相比，SHR的血壓值(SBP、DBP、MAP)明顯增高(P<0.01)。

Fig 2 Comparison of blood pressure values between

3.2 血管內(nèi)皮對(duì)大鼠腸系膜動(dòng)脈血管收縮反應(yīng)的影響給予不同濃度的PE收縮血管，觀察其對(duì)大鼠腸系膜動(dòng)脈血管直徑的影響(Fig 3)，WKY和SHR腸系膜動(dòng)脈對(duì)PE的收縮反應(yīng)呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性，隨PE濃度增加，血管收縮逐漸增大；無(wú)論內(nèi)皮完整還是去除時(shí)，各濃度PE誘發(fā)的SHR血管收縮反應(yīng)均明顯大于WKY大鼠(P<0.05)。內(nèi)皮完整時(shí)，當(dāng)PE濃度為10-7mol·L-1～10-4mol·L-1時(shí)，WKY和SHR腸系膜動(dòng)脈收縮率分別為(3.21±0.32)%vs(8.96±1.00)% (P<0.01)、(7.56±0.90)%vs(15.93±0.92)% (P<0.01)、(30.59±1.00)%vs(40.78±0.63)% (P<0.01)、(34.52±0.40)%vs(44.56±0.68)% (P<0.01)。內(nèi)皮去除時(shí)，當(dāng)PE濃度為10-8～10-4mol·L-1時(shí)，WKY和SHR腸系膜動(dòng)脈收縮率分別為(1.45±0.23)%vs(5.87±0.20)% (P<0.01)、(2.84±0.27)%vs(12.65±0.36)% (P<0.01)、(23.72±0.53)%vs(30.46±0.47)% (P<0.01)、(37.71±0.51)%vs(46.15±0.46)% (P<0.01)、(39.17±0.43)%vs(48.16±0.41)% (P<0.05)。而WKY和SHR內(nèi)皮去除組分別與其內(nèi)皮完整組相比，收縮反應(yīng)增強(qiáng)，當(dāng)PE濃度為10-6mol·L-1～10-5mol·L-1時(shí)，WKY腸系膜動(dòng)脈收縮率分別為(7.59±0.90)%vs(23.72±0.53)% (P<0.01)、(30.59±1.00)%vs(37.71±1.25)% (P<0.01)。當(dāng)PE濃度為10-8mol·L-1～10-5mol·L-1時(shí)，SHR腸系膜動(dòng)脈收縮率分別為(5.16±0.92)%vs(5.87±0.20)% (P<0.05)、(8.96±1.00)%vs(12.65±0.36)% (P<0.01)、(15.93±0.92)%vs(30.46±0.47)% (P<0.01)、(40.78±0.63)%vs(46.15±0.46)% (P<0.01)。

Fig 3 Comparison of contractions and diastolic amplitudes of mesenteric artery inWKY and n=6)

3.3 血管內(nèi)皮對(duì)大鼠腸系膜動(dòng)脈血管舒張反應(yīng)的影響給予不同濃度的ACh、SNP舒張血管后，觀察其對(duì)大鼠腸系膜動(dòng)脈血管直徑的影響(Fig 4)，WKY和SHR腸系膜動(dòng)脈對(duì)ACh、SNP的舒張反應(yīng)呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性，隨ACh、SNP濃度的增加，血管舒張逐漸增大。內(nèi)皮完整時(shí)，各濃度ACh誘發(fā)的SHR血管舒張反應(yīng)均明顯小于WKY大鼠(P<0.01)；內(nèi)皮去除時(shí)，各濃度SNP誘發(fā)的SHR血管舒張反應(yīng)均明顯大于WKY大鼠(P<0.01)，當(dāng)ACh濃度為10-7mol·L-1～10-6mol·L-1時(shí)，WKY和SHR腸系膜動(dòng)脈舒張率分別為(48.00±3.68)%vs(17.50±2.87)% (P<0.01)、(61.40±2.32)%vs(26.50±1.89)% (P<0.01)。當(dāng)SNP濃度為10-7mol·L-1～10-5mol·L-1時(shí)，WKY和SHR腸系膜動(dòng)脈舒張率分別為(2.86±0.50)%vs(21.59±0.30)% (P<0.01)、(7.37±0.68)%vs(40.10±0.40)% (P<0.01)、(13.78 ±1.22)%vs(46.41±0.12)% (P<0.05)。

Fig 4 Comparison ofcontractions and diastolic amplitudes of mesenteric artery inWKY and SHR n=6)

4 討論

機(jī)體微血管對(duì)組織器官的血流供應(yīng)以及正常血壓的維持發(fā)揮著重要作用[7]，微血管結(jié)構(gòu)功能障礙也是高血壓、冠心病、中風(fēng)等疾病的危險(xiǎn)因素。研究表明，高血壓為心腦血管疾病的主要誘因，發(fā)病的關(guān)鍵部位在血管，直接發(fā)病環(huán)節(jié)為外周血管阻力增高[8]，嚴(yán)重影響著人們的身心健康；同時(shí)微動(dòng)脈與大動(dòng)脈血管功能損傷也是高血壓發(fā)病的主要原因。完整的血管內(nèi)皮在調(diào)節(jié)血管張力、正常血壓的維持、抑制血小板粘附和聚集以及白細(xì)胞的粘附、平滑肌細(xì)胞增殖等生理過(guò)程中具有重要作用[9]。在高血壓的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，血管內(nèi)皮在受到高血糖、高血脂、氧化應(yīng)激及體內(nèi)高濃度的同型半胱氨酸等一系列有害因素作用時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞釋放的舒血管因子減少，縮血管因子增多，打破了血管平衡穩(wěn)態(tài)，從而導(dǎo)致血管收縮功能異常等一系列心腦血管事件的發(fā)生[10-11]。本研究結(jié)果也表明：SHR腸系膜動(dòng)脈呈現(xiàn)明顯的血管收縮和舒張功能障礙。

血管內(nèi)皮細(xì)胞是襯于心、血管和淋巴管內(nèi)表面的單層扁平或多角形細(xì)胞，可通過(guò)分泌一系列血管活性物質(zhì)發(fā)揮調(diào)節(jié)血管緊張性、抗血栓形成、抑制平滑肌細(xì)胞增殖及血管壁炎癥反應(yīng)等功能[12]。內(nèi)皮功能障礙是多種心血管疾病的標(biāo)志(血管收縮、血栓形成和炎癥反應(yīng))，通過(guò)合成和釋放內(nèi)皮源性收縮因子(超氧陰離子、血栓素A2、內(nèi)皮素、血管緊張素II等)、舒張因子(NO、前列環(huán)素I2、ACh、內(nèi)皮源性超極化因子等)，在血管張力、血壓調(diào)節(jié)、凝血、炎癥等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，對(duì)于維持血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，血管內(nèi)皮起著至關(guān)重要的作用。所以，微血管、血管內(nèi)皮已成為心腦血管疾病研究的重要方向。

已有的血管張力、壓力肌動(dòng)技術(shù)報(bào)道，對(duì)大動(dòng)脈和小動(dòng)脈的血管功能研究報(bào)道也是相互混淆。目前已有的血管內(nèi)皮去除的研究報(bào)道多為機(jī)械(棉簽、鋼絲、頭發(fā)絲摩擦等)和藥物(注射Triton X-100溶液)去除兩種方式[13-14]。筆者認(rèn)為已有研究報(bào)道的血管內(nèi)皮去除方式多適用于大動(dòng)脈、血管張力的研究，由于微血管壓力肌動(dòng)研究屬于等張收縮研究，且血管直徑過(guò)小，操作困難，對(duì)血管活性的要求高于普通血管張力系統(tǒng)的研究，已有報(bào)道的血管內(nèi)皮去除方式并不完全適用于微動(dòng)脈的研究。本研究采取壓力肌動(dòng)技術(shù)檢測(cè)微血管功能，該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于對(duì)血管本身及血管活性損傷較小，更好的模擬動(dòng)物體內(nèi)環(huán)境。本技術(shù)不同于普通血管張力研究，鋼絲需穿過(guò)血管的方式，容易損傷血管內(nèi)皮，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果缺乏準(zhǔn)確性[15]。本研究采取血管套接在玻璃微電極(直徑約50μm)，鑷子只需捏住套接電極的部分，而需要檢測(cè)的血管段保留其血管結(jié)構(gòu)和功能的完整性，降低實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的誤差。對(duì)于血管內(nèi)皮的去除，本研究摒棄以往棉簽、鋼絲摩擦的方式，采取機(jī)械和藥物相結(jié)合的方式，將血管?chē)@玻璃微電極尖端輕輕旋轉(zhuǎn)1圈[4]，血管一端套接完成后，向血管內(nèi)推注氣體，破壞血管內(nèi)皮。上述方式保證血管的良好活性，但不能保證血管內(nèi)皮完全去除，所以給藥階段繼續(xù)給予吲哚美辛(環(huán)氧合酶抑制劑)、L-NAME(NO合酶抑制劑)共同預(yù)孵育血管20 min，抑制內(nèi)皮源性舒張因子(NO、前列環(huán)素I2)的釋放，且吲哚美辛和L-NAME持續(xù)存在于整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程[5]。本研究方法不同于已有研究報(bào)道的單純將血管?chē)@玻璃微電極尖端旋轉(zhuǎn)1圈[4]或者向血管內(nèi)推注氣體，容易損傷血管，降低血管活性，不能更好的模擬動(dòng)脈生理狀態(tài)，且不能保證血管內(nèi)皮去除的程度。本研究在綜合既往研究報(bào)道的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)踐，證明本血管內(nèi)皮去除的方法，可以大大降低對(duì)血管活性的損傷，更好的保證了血管的活性，結(jié)構(gòu)、功能的完整性，提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。在本研究中，每個(gè)內(nèi)皮去除的血管環(huán)，均給予KCl收縮血管，待穩(wěn)定后，給予ACh舒張血管，幅度小于10%，可以認(rèn)為血管內(nèi)皮的去除。本研究結(jié)果顯示：血管內(nèi)皮去除后，WKY和SHR的血管收縮增強(qiáng)，以10-5mol·L-1最明顯(P<0.01)。對(duì)血管舒張的檢測(cè)，內(nèi)皮完整時(shí)，與WKY大鼠相比，SHR的舒張功能明顯減弱；內(nèi)皮去除后，給予內(nèi)皮非依賴性血管舒張劑SNP，WKY大鼠的舒張反應(yīng)明顯減弱，本研究結(jié)果與已有的研究相似，高血壓大鼠血管收縮反應(yīng)增強(qiáng)，舒張反應(yīng)減弱。筆者認(rèn)為此血管內(nèi)皮去除的技術(shù)方法可以用于之后的微血管內(nèi)皮功能障礙研究中，以提高微血管測(cè)量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。

(致謝: 本實(shí)驗(yàn)在新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝課題組成員的幫助與支持。)