司遠(yuǎn)青，顏貴明

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，安徽 合肥 230012)

酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver disease，AFLD)是指由于長期大量飲酒導(dǎo)致的肝臟脂肪代謝異常的疾病。當(dāng)人攝入酒精時，進(jìn)入機(jī)體的大部分酒精會在肝臟被代謝，影響肝臟脂肪代謝，最終導(dǎo)致肝內(nèi)的脂肪堆積，脂肪變性、壞死，形成脂肪肝，甚至進(jìn)一步形成肝炎或肝纖維化等。

腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK)作為外周組織中能量平衡的主要傳感器，當(dāng)能量代謝的平衡被打破時，其將被磷酸化并激活[1]。AMPK信號一旦被激活，就會抑制能量生物合成途徑和活化能量代謝途徑。McCullough等[2]就提出了代謝應(yīng)激可引起AMPK的變化。SREBP1c(固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c)做為AMPK其中一個下游蛋白激酶，參與脂肪酸的合成與代謝[3]。CaMKKβ(鈣調(diào)蛋白激酶)，涉及能量平衡調(diào)節(jié)，做為AMPK上游激酶，可以通過其磷酸化來激活A(yù)MPK。有研究將小鼠的CaMKKβ基因敲除可免受飲食引起的肥胖、胰島素抵抗和葡萄糖耐受等的影響[4]。脂聯(lián)素(adiponectin，Adip)作為脂肪細(xì)胞分泌的一種具有生物活性的蛋白質(zhì)因子，可參與調(diào)節(jié)體內(nèi)能量代謝[5]。丹皮酚(paeonol，Pae)是從毛茛科植物牡丹干燥根皮中提取出的一種有效的成分，具有抗炎、抗氧化、降脂質(zhì)、抑制脂肪過氧化等多種作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚對AFLD大鼠有較好的治療作用，可以減輕酒精引起的肝細(xì)胞損傷[6]，但是否通過Adip/CaMKKβ/AMPK這一通路發(fā)揮作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬從該通路入手研究丹皮酚治療小鼠酒精性脂肪肝的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 8周齡健康♂ KM小鼠，SPF級，體質(zhì)量(40±2)g。由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號: SCXK(蘇) 2016-0010。小鼠自由進(jìn)食、飲水，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)室常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.1.2藥物與試劑 丹皮酚(paeonal，Pae)，南京澤郎生物科技有限公司，批號：ZL150806；水飛薊賓(silibinin，Sil)膠囊，天津天士力圣特制藥有限公司，批號：750705069；56度永豐牌二鍋頭，北京二鍋頭酒業(yè)股份有限公司，批號：SC11511150818017；蘇木素-伊紅(HE)染色液，北京雷根生物，批號：0419A18；IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒，上海一研生物科技有限公司，批號：201812；甘油三酯(TG)和總膽固醇(T-CHO)測試盒，南京建成生物工程研究所，批號：20181208；ALT和AST試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號：20181207；小鼠脂聯(lián)素(APN/ADP)ELISA試劑盒，酶免商城，批號：MM-0547M2；小鼠乙酰輔酶A羧化酶(ACC)ELISA試劑盒，酶免商城，批號：MM-0757M2；Fast Quant RT Kit(with gDNase)，天根生化科技(北京)有限公司，批號：04214；Trizol試劑盒，Invitrogen公司，批號：184608；β-actin、AMPKα、CaMKKβ、AdipR1和SREBP1c引物購于上海生工。兔抗β-actin、AMPKα、CaMKKβ、P-AMPKα、P-CaMKKβ、AdipR1和SREBP1c一抗及二抗(羊抗兔)購于Affinity公司。

1.1.3主要儀器 YD-315切片機(jī)(金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司)；YD-AB生物組織攤烤片機(jī)(金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司)；TS-12A生物組織自動脫水機(jī)(湖北省孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司)；YD-6L生物組織冷凍包埋機(jī)(金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司)；OLYMPUSBX51正置顯微鏡(上海富萊光學(xué)公司)；K3型酶標(biāo)儀(LabServ公司)；Thermo ABI 7500 實(shí)時熒光定量PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司); FCM型凝膠成像儀(美國proteinsimple公司)；基因擴(kuò)增儀(杭州柏恒科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1AFLD小鼠模型的復(fù)制[7]110只KM ♂小鼠隨機(jī)分為兩組：空白對照組(Control)和模型組，前者10只，后者100只。空白對照組灌胃生理鹽水，模型組灌胃56度白酒，灌胃體積為12 mL·kg-1，每天上午灌胃1次。1周后，每天取模型組小鼠2只處死，肉眼觀察肝臟變化，并留取肝臟做病理切片，觀察肝臟病變情況。與空白對照組小鼠相比，造模2周后，小鼠肝臟病理切片有明顯的脂滴空洞，符合AFLD的特征。剩余小鼠繼續(xù)下述實(shí)驗(yàn)。

1.2.2動物分組與給藥 造模成功的小鼠隨機(jī)分為以下3組：模型組(EtOH 12 mg·kg-1)、陽性藥組(Sil+ EtOH 23 mg·kg-1)和丹皮酚組(Pae+EtOH 300 mg·kg-1)，灌胃體積12 ml·kg-1，10只正常對照組小鼠給予等體積的生理鹽水，均連續(xù)干預(yù)1周。

1.2.3小鼠活動狀態(tài)觀察 每日觀察小鼠的外觀、毛色、活動、食量、排便等狀態(tài)，每隔1 d稱一次體重。

1.2.4標(biāo)本處理及指標(biāo)檢測 藥物干預(yù)1周后，取材前一晚禁食不禁水。次日上午稱重、麻醉、摘眼球取血。取完血后立即摘取肝臟，用冷的生理鹽水清洗肝臟表面后，將肝臟分為三部分，第一部分用10%中性福爾馬林浸泡用于病理檢測，第二部分和第三部分于-80 ℃保存，用于后期PCR實(shí)驗(yàn)和Western blot蛋白印跡實(shí)驗(yàn)。

1.2.5血清生化指標(biāo)檢測 在末次給藥2 h后，水合氯醛麻醉，摘眼球取血，靜置2 h后，3 000 r·min-1離心10 min,取上層血清，-20℃保存。用于血清TG、TC、ALT、AST、IL-6、IL-1β、TNF-α、Adip和ACC的含量測定。上述血清學(xué)檢測皆按照相應(yīng)試劑盒測定。

1.2.6組織病理學(xué)檢測 取出在10%中性福爾馬林中固定的肝組織，脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色。200倍光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織的形態(tài)學(xué)方面的改變。

1.2.7基因水平檢測

1.2.7.1 小鼠肝臟組織中的RNA提取 末次給藥后，禁食不禁水18 h后麻醉，迅速取出肝臟，預(yù)冷的生理鹽水清洗，研磨，按照Trizol試劑盒的要求提取小鼠肝臟的總RNA。取5 μL總RNA加入95 μL ddH2O混勻，分別測定OD260、OD280的值，OD260/OD280值均在1.8～2.0之間。再通過公式：RNA濃度(g·L-1)=(OD260×40×稀釋倍數(shù))/1 000來計算RNA的濃度，使用無菌RNase水將濃度調(diào)至一致。

1.2.7.2 cDNA合成 使用Fast Quant RT Kit(with gDNase)此試劑盒，根據(jù)說明書要求：在冰浴的nuclease-free管中分別加入total RNA 3 μL、5×g DNA Buffer 2 μL和RNase-Free ddH2O 5 μL徹底混勻，簡短離心，置于42 ℃，孵育3 min。再加入以下試劑的混合物：10×Fast RT Buffer 2 μL、RT Enzyme Mix 1 μL、FQ-RT Primer MIX 2 μL 和 RNase-Free ddH2O 5 μL。充分混勻后，42 ℃，孵育15 min；95 ℃，孵育3 min，即得到cDNA；之后置于冰上放置。

1.2.7.3 引物設(shè)計 所有引物采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計，委托上海生工生物有限公司合成，各引物序列見Tab 1。引物開蓋前先4 000 r·min-1, 30～60 s離心。輕輕開蓋后加入相對應(yīng)體積的DEPC水混勻，得到100 μmol·L-1的引物。將其稀釋10倍分裝，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7.4 半定量PCR 取nuclease-free管置于冰盒上，按照試劑盒要求配制反應(yīng)體系：Easy Taq PCR SuperMix(2×)12.5 μL,引物f (10 μmol·L-1) 0.5 μL, 引物r(10 μmol·L-1) 0.5 μL, DEPC水11 μL, cDNA 0.5 μL。將混合均勻的反應(yīng)體系混合液瞬時離心去除氣泡后，放置于基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、 72 ℃ 30 s，35個循環(huán);72℃ 10 min之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電壓110 V，時間27 min，于凝膠成像儀曝光成像。

1.2.7.5 實(shí)時熒光定量PCR 取nuclease-free管置于冰上，按照試劑盒要求配制反應(yīng)體系：SYBR Green qPCR Master Mix(2×)12.5 μL,引物f(10 μmol·L-1) 1 μL, 引物r(10 μmol·L-1)1 μL, DEPC水10 μL, cDNA 0.5 μL。將混合均勻的反應(yīng)體系混合液瞬時離心去除氣泡后，放置于ABI 7500實(shí)時熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序：95 ℃ 1 min; 95 ℃ 15 s、50 ℃ 15 s、 72 ℃ 45 s，40個循環(huán); 95 ℃ 15 s; 60 ℃ 1 min.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，內(nèi)參基因?yàn)棣?actin，目的基因?yàn)锳dipR1、CaMKKβ、AMPKα和SREBP1c。分別測定上述基因的Ct值，計算各基因各組的Ct值平均值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為：2-△△Ct。

Tab 1 Primer sequences of PCR

1.2.8蛋白水平檢測

1.2.8.1 小鼠肝組織蛋白提取 從-80 ℃冰箱中取出冰凍的肝組織，各組約100 mg，剪碎，按照試劑盒說明書對組織進(jìn)行蛋白抽提，得到各組總蛋白后，用BCA試劑盒測定蛋白濃度，蛋白存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8.2 Western blot檢測蛋白水平表達(dá) 采用10% SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，濕法轉(zhuǎn)模；5% BSA室溫封閉2 h，TBST緩沖液洗滌4次，每次5 min；一抗分別按照β-actin(兔抗，1 ∶1 000)、AdipR1(兔抗，1 ∶1 000)、CaMKKβ(兔抗，1 ∶1 000)、p-CaMKKβ(兔抗，1 ∶500)、AMPKα(兔抗，1 ∶1 000)、p-AMPKα(兔抗，1 ∶500)、SREBP1c(兔抗，1 ∶1 000)用5%BSA稀釋，把對應(yīng)的膜浸沒在對應(yīng)的一抗中，4 ℃孵育過夜；取出后，TBST緩沖液洗滌4次，每次5 min；二抗(羊抗兔，1 ∶10 000)室溫孵育2 h，TBST緩沖液洗滌4次，每次5 min；顯影曝光。

2 結(jié)果

2.1 動物一般狀態(tài)觀察造模2周，模型組小鼠出現(xiàn)毛色灰暗無光澤，活動量減少，小鼠體質(zhì)量減輕；正常對照組小鼠毛色光滑，活動積極，食量與排便正常；給藥1周后，各給藥組毛色略有改善，活動量與精神狀態(tài)也略有改善。各組小鼠體質(zhì)量(Fig 1)有變化，但無統(tǒng)計學(xué)意義。

Fig 1 Line chart of mouse weight

2.2 肝臟組織病理學(xué)變化如Fig 2顯微鏡所示，正常組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)無脂滴形成，肝細(xì)胞無脂肪變性；模型組小鼠肝細(xì)胞中出現(xiàn)小而密的脂滴，炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性；水飛薊賓組幾乎未存在圓形的脂滴空洞和炎性細(xì)胞；丹皮酚組有較水飛薊賓組略多的圓形脂滴空洞和炎性細(xì)胞浸潤。水飛薊賓與丹皮酚都在一定程度上減輕肝細(xì)胞的脂肪變性與炎性細(xì)胞浸潤。

Fig 2 Histopathological features of liver(HE×200)

2.3 丹皮酚對血清中TG、TC 含量的影響模型組小鼠血清中TG與TC含量明顯高于正常組；兩個用藥組皆有不同程度的改善模型組的升高情況，但就TG含量上，丹皮酚比水飛薊賓降低；TC含量上，兩用藥組差異無顯著性。可見丹皮酚能更有效地降低酒精誘導(dǎo)導(dǎo)致的酒精肝中甘油三酯的含量。見Fig 3。

Fig 3 Effect of Pae on TG and TC in mice with alcoholic fatty

2.4 丹皮酚對血清中IL-6、IL-1β和TNF-α含量的影響酒精誘導(dǎo)小鼠AFLD模型，血清中IL-6含量幾乎無變化，IL-1β和TNF-α皆有升高；水飛薊賓組與丹皮酚組調(diào)節(jié)上述3種炎癥因子差異無顯著性，血清中IL-6含量依然幾乎無變化，IL-1β與TNF-α對酒精誘導(dǎo)引起的含量升高情況有明顯改善。見Fig 4。

Fig 4 Effect of Pae on IL-6, IL-1β and TNF-αin mice

2.5 丹皮酚對血清中Adip和ACC含量的影響通過ELISA試劑盒檢測，模型組小鼠血清中Adip含量低于正常組，給予水飛薊賓和丹皮酚給藥組可改善模型組Adip含量降低情況，但仍與正常組差異有顯著性。同時對血清中ACC進(jìn)行檢測，相對于正常組，模型組小鼠血清中ACC含量升高，兩給藥組皆降低ACC含量，且水飛薊賓組比丹皮酚組更大程度降低其含量。見Fig 5。

Fig 5 Effect of Pae on Adip and ACC in mice with alcoholic fatty

2.6 丹皮酚對肝臟組織中AdipR、CaMKKβ、AMPK和SREBP1c核酸水平的影響與正常組相比，模型組與兩用藥組AdipR1皆無差異，見Fig 6。對于CaMKKβ和AMPKα，與正常組相比，模型組皆降低(Fig 6A)，分別下調(diào)6.223和5.071倍，水飛薊賓組分別下調(diào)1.618和1.893倍，丹皮酚組分別下調(diào)2.902和2.900倍(Fig 6B)，明顯改善模型組下調(diào)情況。對于SREBP1c，與正常組相比，模型組皆上升(Fig 6A)，上調(diào)5.702倍，水飛薊賓組上調(diào)1.797倍，丹皮酚組下調(diào)2.779倍(Fig 6B)，顯著改善模型組上調(diào)情況。

2.7 丹皮酚對肝臟組織中AdipR1、CaMKKβ、AMPKα、SREBP1c蛋白水平的影響從Fig 7結(jié)果可知，與正常組相比，模型組與兩用藥組AdipR1皆差異無顯著性。對于磷酸化CaMKKβ和AMPKα，與正常組相比，模型組皆降低；水飛薊賓組和丹皮酚組皆改善酒精誘導(dǎo)引起的該蛋白磷酸化水平表達(dá)下調(diào)現(xiàn)象，同時，水飛薊賓比丹皮酚更大程度改善此現(xiàn)象。而對于SREBP1c，與正常組相比，模型組該蛋白表達(dá)上升，水飛薊賓組與丹皮酚組皆有一定程度下調(diào)，明顯改善模型組上調(diào)情況，且兩用藥組差異無顯著性。結(jié)合核酸水平與蛋白水平的結(jié)果(Fig 6，F(xiàn)ig 7)，丹皮酚與水飛薊賓皆可通過對Adip/CaMKKβ/AMPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)來改善小鼠酒精性脂肪肝。

3 討論

AMPK系統(tǒng)是細(xì)胞能量狀態(tài)的傳感器，AMPK的α亞基一旦被激活，AMPK就會同時抑制能量消耗的生物合成途徑和產(chǎn)ATP的分解代謝途徑。AMPK若被抑制則促進(jìn)肥胖患者的脂肪生成增加，膽固醇和糖原合成增加，糖原異生，而脂肪酸氧化和血清葡糖糖攝取過程減少[8]。有研究表明，在HeLa細(xì)胞中，增加的[Ca2+]激活CaMKKβ/AMPK通路，其參與黃芩苷對體內(nèi)肝臟脂肪變性和肥胖的發(fā)展的保護(hù)作用[9]。減少脂肪細(xì)胞中的cAMP積累可改善乙醇刺激的脂肪脂解，這個過程和Ca2+/CaMKKβ/AMPK信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)相關(guān)，從而阻止脂肪酸從頭合成與轉(zhuǎn)運(yùn)。

同時有研究稱，AMPKα激活可抑制SREBP1c，有助于多酚和二甲雙胍在高糖加胰島素條件下抑制肝細(xì)胞中SREBP1c的蛋白水解切割和核轉(zhuǎn)位的能力，降低飲食誘導(dǎo)的肝臟和血漿中TG和TC水平[9]。SREBP1c是與其靶基因(如FAS，ACC和SCD-1)結(jié)合的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可從而引發(fā)肝臟脂肪生成。以前有研究表明，果糖可通過上調(diào)SREBP1c，F(xiàn)AS，SCD-1和ACC1的表達(dá)來促進(jìn)脂肪生成[10-11]。AMPKα抑制SREBP1c轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中，以此來下調(diào)脂肪生成相關(guān)基因的表達(dá)[12]。

Fig 6 Expression of AdipR, CaMKKβ, AMPKα and SREBP1c genes in mice with alcoholic fatty

Fig 7B Expression of AdipR, CaMKKβ, AMPKα and SREBP1c in mice with alcoholic fatty

本次實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)在酒精誘導(dǎo)引起的小鼠酒精肝中，核酸水平上的CaMKKβ與AMPKα表達(dá)被抑制，SREBP1c表達(dá)卻是上調(diào)；蛋白水平上，CaMKKβ和AMPKα的磷酸化被抑制，SREBP1c表達(dá)量增加。可見CaMKKβ活化后可誘導(dǎo)AMPK活化，而AMPK活化會抑制SREBP1c表達(dá)。在小鼠AFLD中，CaMKKβ和AMPKα表達(dá)被抑制，從而AMPK對SREBP1c表達(dá)的抑制作用就相對被減弱，導(dǎo)致脂肪分解代謝障礙而引起脂肪變性。這與一些文獻(xiàn)報道的結(jié)果一致。同時，不管是核酸水平還是蛋白水平都驗(yàn)證了丹皮酚可一定程度的改善酒精誘導(dǎo)引起的上述情況。

本實(shí)驗(yàn)中，小鼠肝臟組織中AdipR1 的mRNA水平無變化，在蛋白水平上，僅模型組出現(xiàn)略微上升，而在ELISA檢測中Adip水平出現(xiàn)明顯下降。正如You等[13]提出，Adip有AdipR1和 AdipR2兩個受體，作為Adip介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致脂肪酸氧化增加，并減少包括肝臟在內(nèi)的多個器官的脂肪積累，主要通過AdipR2，AdipR1幾乎無顯著性變化。在AFLD大鼠模型中，肝臟AdipoR2在mRNA和蛋白表達(dá)，以及血清總Adip表達(dá)均降低[14]。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)從核酸水平和蛋白水平驗(yàn)證了丹皮酚對AFLD小鼠的保護(hù)作用與Adip/CaMKKβ/AMPK這條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)有關(guān)。同時水飛薊賓作為陽性對照藥也可能通過干預(yù)了此信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來對AFLD小鼠肝損傷進(jìn)行保護(hù)作用，丹皮酚與水飛薊賓二者對上述信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)保持一致，但在甘油三酯含量上，丹皮酚比水飛薊賓更有效降低AFLD小鼠的甘油三酯水平。

有文獻(xiàn)報道[14]，Adip可抑制脂多糖刺激Kupffer細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞中TNF-α的產(chǎn)生，Adip和TNF-α聯(lián)合可抑制脂肪細(xì)胞中的基因表達(dá)，蛋白質(zhì)合成和產(chǎn)生。在酒精性肝損傷早期階段，大鼠血清中的TNF-α增加，對于Adip的酒精誘導(dǎo)的抑制作用可以通過增強(qiáng)TNF-α產(chǎn)生來介導(dǎo)，其反過來可以通過旁分泌或內(nèi)分泌機(jī)制抑制脂肪組織中的Adip表達(dá)。因此，Adip產(chǎn)生的失調(diào)可導(dǎo)致多種肝臟問題，包括脂肪變性，這是酒精性肝病的早期階段。同時有臨床隨機(jī)對照實(shí)驗(yàn)報道稱[15]，NAFLD患者Adip水平降低與炎癥因子(如TNF-α)增加相關(guān)，姜黃素可減少脂肪組織的巨噬細(xì)胞浸潤，增加Adip的產(chǎn)生并抑制肝臟炎癥因子。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，AFLD小鼠血清中的Adip水平下降，TNF-α水平提高，與上述文獻(xiàn)報道一致。因此，本實(shí)驗(yàn)在研究丹皮酚治療小鼠AFLD的作用機(jī)制中，Adip/CaMKKβ/AMPK該通路參與此過程，對酒精性脂肪肝治療提供理論依據(jù)。但本實(shí)驗(yàn)未在AFLD進(jìn)展過程中的個時間段進(jìn)行驗(yàn)證，未能充分確定Adip/CaMKKβ/AMPK這條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和炎癥因子的表達(dá)水平的變化與疾病發(fā)生發(fā)展的因果關(guān)系。因此，本實(shí)驗(yàn)后期將針對疾病繁盛發(fā)展過程各時間節(jié)點(diǎn)的此信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的變化來進(jìn)一步驗(yàn)證。