靳曉飛，張彐寧，周曉紅，高維娟

(河北中醫(yī)學(xué)院，河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050200)

腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemia/reperfusion injury，CIRI)是嚴(yán)重影響缺血性腦血管病溶栓治療效果的重要病理過程，其發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，氧化應(yīng)激損傷和氧自由基連鎖反應(yīng)是腦缺血/再灌注引起二次損傷的關(guān)鍵因素[1]。自噬(autophagy)是細(xì)胞在應(yīng)激條件下的一種自我保護(hù)過程，可將損傷的生物大分子或細(xì)胞器及時(shí)包裹、分解，產(chǎn)生新的能量物質(zhì)，供細(xì)胞循環(huán)再利用，從而維持細(xì)胞自身穩(wěn)態(tài)[2]。大量研究發(fā)現(xiàn)[3]，腦缺血/再灌注損傷可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，而激活自噬又可以減輕CIRI，提高神經(jīng)元存活，發(fā)揮保護(hù)作用。中藥黃芪是臨床常用補(bǔ)氣要藥，因其補(bǔ)氣又兼活血之功，使氣盛則血行，瘀去而經(jīng)脈通暢，目前在治療缺血性腦血管病方面效果明顯。黃芪甲苷(astragaloside Ⅳ，AST)是黃芪的代表性活性單體成分，具有抗凋亡、抗衰老、抗病毒、抗炎等藥理作用[4-5]。本課題組前期細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，黃芪甲苷可上調(diào)自噬，減輕CIRI[6-7]，但其作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究以在神經(jīng)系統(tǒng)疾病體外研究應(yīng)用廣泛的PC12細(xì)胞(類神經(jīng)元)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在細(xì)胞水平，從自噬和氧化應(yīng)激角度，探討黃芪甲苷拮抗CIRI的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞PC12細(xì)胞，亦稱為類神經(jīng)元，經(jīng)過NGF生長(zhǎng)因子處理后具有神經(jīng)元的生理特性，購(gòu)買于BOSTER公司。

1.2 試劑和儀器主要試劑：黃芪甲苷購(gòu)買于上海士峰生物公司，規(guī)格為20 mg/瓶，純度≥98%，生產(chǎn)批號(hào)為15082136；DMEM培養(yǎng)基(高糖)由Gibco公司生產(chǎn)；胎牛血清由杭州四季青生物公司生產(chǎn)；Earle’s平衡鹽溶液(無糖)由LEAGENE公司生產(chǎn)；胰蛋白酶、PBS緩沖液、青鏈霉素混合液由北京索萊寶生物公司生產(chǎn)；自噬抑制劑3-MA由Sigma公司生產(chǎn)；MDC法自噬檢測(cè)試劑盒購(gòu)買于江蘇凱基生物公司；CCK-8試劑盒、ELISA試劑盒購(gòu)買于北京莊盟國(guó)際生物公司；Beclin1兔抗大鼠單克隆抗體購(gòu)買于Abcam公司。主要儀器：普通細(xì)胞培養(yǎng)箱3111型、三氣低氧培養(yǎng)箱3131型、多功能全波長(zhǎng)讀數(shù)儀Varioskan LUX型由Thermo公司生產(chǎn)；透射電子顯微鏡H-7650型由HITACHI公司生產(chǎn)；全電動(dòng)倒置熒光顯微鏡Axio Observer 7型由Zeiss公司生產(chǎn)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(高糖)培養(yǎng)，細(xì)胞置于普通培養(yǎng)箱(CO2培養(yǎng)箱)內(nèi)正常培養(yǎng)，每3 d換液1次，細(xì)胞密度生長(zhǎng)至70%～80%傳代。

1.4 氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖模型建立和實(shí)驗(yàn)分組將對(duì)數(shù)期PC12細(xì)胞分為4組：正常組(Normal)、模型組(氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖組，Model)、黃芪甲苷組(AST)、自噬抑制劑+黃芪甲苷組(3-MA+ AST)。除了正常組之外，其余3組均需建立氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖模型：各組細(xì)胞棄去正常培養(yǎng)基(DMEM高糖培養(yǎng)基，含10%的胎牛血清)，換為Earle’s培養(yǎng)基(無糖)，模擬細(xì)胞缺血狀態(tài)，并將細(xì)胞立即放入三氣低氧培養(yǎng)箱(1%O2+94%N2+5%CO2，濕度適宜，37 ℃)，氧糖剝奪3 h。隨后，將細(xì)胞取出，更換培養(yǎng)基為正常細(xì)胞培養(yǎng)基，并將細(xì)胞放入普通培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)(即復(fù)氧復(fù)糖)12 h。其中，黃芪甲苷組、自噬抑制劑+黃芪甲苷組在復(fù)氧復(fù)糖開始的同時(shí)分別予以黃芪甲苷和自噬抑制劑3-MA +黃芪甲苷處理，黃芪甲苷作用濃度為100 μmol·L-1，自噬抑制劑3-MA作用濃度為5 mmol·L-1；正常組不做其他處理，正常培養(yǎng)即可。

1.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性將細(xì)胞以1×105個(gè)/mL密度接種至96孔板，普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖造模和給藥處理。隨后，參照CCK-8試劑盒說明書步驟，給予CCK-8處理，普通培養(yǎng)箱孵育1 h。多功能全波長(zhǎng)讀數(shù)儀(波長(zhǎng)調(diào)整為490 nm)檢測(cè)各孔細(xì)胞吸光度值(即OD值)，OD值越大說明細(xì)胞活性越高。

1.6 ELISA法檢測(cè)MDA含量、SOD和GSH-Px活性將細(xì)胞以1×105個(gè)/mL密度接種至96孔板，普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行造模和給藥處理。隨后，對(duì)各組細(xì)胞消化、離心、PBS清洗，收集各組細(xì)胞，4 ℃條件下將細(xì)胞機(jī)械勻漿，離心，取各組細(xì)胞上清液，參照ELISA試劑盒說明書步驟，檢測(cè)各組細(xì)胞MDA含量、SOD和GSH-Px活性。多功能全波長(zhǎng)讀數(shù)儀(波長(zhǎng)調(diào)整為450 nm)檢測(cè)各孔細(xì)胞OD值。用標(biāo)準(zhǔn)物濃度和OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立直線回歸方程式，計(jì)算各組細(xì)胞MDA、SOD、GSH-Px濃度。

1.7 透射電鏡觀察自噬小體變化對(duì)各組細(xì)胞消化、離心(1 000 r·min-1)、PBS清洗3次，隨后用2.5%的戊二醛對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定4 h，清洗細(xì)胞3次。然后用1%的餓酸對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定2 h，50%、70%、80%、90%、100%不同濃度的丙酮對(duì)細(xì)胞進(jìn)行脫水2遍，包埋劑與丙酮不同比例滲透細(xì)胞，37 ℃和60 ℃恒溫箱對(duì)細(xì)胞進(jìn)行聚合處理。超薄切片機(jī)切片(厚度為50 nm/片)，醋酸鈾和酸鉛雙染切片。透射電鏡觀察自噬小體，拍照，計(jì)算單位面積(μm2)自噬小體數(shù)量。

1.8 MDC熒光染色檢測(cè)自噬小體變化將細(xì)胞以1×105個(gè)/mL密度接種至24孔板，普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖造模和給藥處理。隨后，4%的多聚甲醛對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定25 min，PBS清洗細(xì)胞3次，1×wash buffer清洗細(xì)胞3次。各孔加入MDC工作液100 μL，避光、室溫反應(yīng)45 min，1×wash buffer 清洗細(xì)胞3次。倒置熒光顯微鏡觀察自噬小體(即熒光斑點(diǎn))，拍照，計(jì)算單位面積(mm2)熒光斑點(diǎn)數(shù)量，熒光斑點(diǎn)數(shù)量越多說明自噬小體越多、自噬活動(dòng)越強(qiáng)。

1.9 Western blot檢測(cè)Beclin1蛋白表達(dá)細(xì)胞裂解液裂解各組細(xì)胞，提取總蛋白，測(cè)定各組細(xì)胞蛋白含量。取60 μg樣品，加入Buffer緩沖液，混勻。100 ℃沸水處理10 min，蛋白變性。凝膠電泳分離，蛋白轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉封閉1 h。隨后，加入Beclin1兔抗大鼠單克隆抗體(封閉液稀釋，1 ∶1 000)，4 ℃ 孵育過夜。TBST洗膜液清洗3次(10 min/次)，加入二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育1 h。TBST洗膜液清洗3次，ECL化學(xué)發(fā)光顯色。β-actin作為內(nèi)參。UVP軟件采集圖片結(jié)果，Image J軟件計(jì)算各組灰度值。

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷對(duì)PC12細(xì)胞活性的影響與正常組相比，模型組細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05)，表明細(xì)胞損傷較為明顯；與模型組相比，黃芪甲苷組細(xì)胞活性升高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；自噬抑制劑可明顯拮抗黃芪甲苷提高細(xì)胞活性的作用(P<0.05)。見Fig 1。

Fig 1 Effect of astragaloside Ⅳ on viability of

2.2 黃芪甲苷對(duì)PC12細(xì)胞MDA、SOD、GSH-Px的影響與正常組相比，模型組MDA含量增多、SOD和GSH-Px活性下降(P<0.05)，提示有明顯的氧化應(yīng)激損傷；與模型組相比，黃芪甲苷組MDA含量減少、SOD和GSH-Px活性升高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；自噬抑制劑可明顯拮抗黃芪甲苷降低MDA含量、提高SOD和GSH-Px活性的作用(P<0.05)。見Fig 2。

Fig 2 Effect of astragaloside Ⅳ on MDA, SOD, GSH-Px of PC12 cells n=6)

2.3 黃芪甲苷對(duì)PC12細(xì)胞自噬小體的影響正常組未見自噬小體；模型組可見典型雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體，表明自噬被激活；與模型組相比，黃芪甲苷組自噬小體數(shù)量增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；自噬抑制劑可明顯拮抗黃芪甲苷提高自噬小體數(shù)量的作用(P<0.05)。見Fig 3。

2.4 黃芪甲苷對(duì)PC12細(xì)胞自噬熒光斑點(diǎn)的影響正常組自噬熒光斑點(diǎn)不明顯；模型組自噬熒光斑點(diǎn)數(shù)量增多(P<0.05)，提示自噬被激活；與模型組相比，黃芪甲苷組自噬熒光斑點(diǎn)數(shù)量增多(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；自噬抑制劑可明顯拮抗黃芪甲苷提高自噬熒光斑點(diǎn)數(shù)量的作用(P<0.05)。見Fig 4。

2.5 黃芪甲苷對(duì)PC12細(xì)胞Beclin1蛋白表達(dá)的影響與正常組相比，模型組自噬標(biāo)志蛋白Beclin1表達(dá)增多(P<0.05)；與模型組相比，黃芪甲苷組Beclin1蛋白表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；自噬抑制劑可明顯拮抗黃芪甲苷提高Beclin1蛋白表達(dá)的作用(P<0.05)。見Fig 5。

Fig 3 Effect of astragaloside Ⅳ on autophagosomes of PC12 cells n=6)

3 討論

缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular disease)是一類常見的腦血管疾病，具有發(fā)病率高、致殘和致死率高的特點(diǎn)，其發(fā)病已逐漸呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響人類健康和生活。腦缺血/再灌注損傷是針對(duì)缺血性腦血管病恢復(fù)或重建缺血區(qū)血液灌注時(shí)而出現(xiàn)的一類重要病理?yè)p傷。腦缺血發(fā)生后，及時(shí)恢復(fù)缺血腦組織血流，再灌注可有效減輕腦組織損傷和神經(jīng)功能障礙，但是再灌注期間可產(chǎn)生大量的活性氧，引起超氧化物自由基、羥基自由基、過氧化氫等增多，造成DNA損傷、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化，最終引起或加重神經(jīng)元損傷[8]。活性氧極易侵襲細(xì)胞膜上的脂質(zhì)，導(dǎo)致脂質(zhì)發(fā)生過氧化，產(chǎn)生大量脂質(zhì)過氧化物，引起細(xì)胞膜通透性、結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變。丙二醛(malonaldehyde，MDA) 作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，被認(rèn)為是檢測(cè)氧化應(yīng)激損傷的重要參考指標(biāo)[9]。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)是一種重要的抗氧化酶，可阻止脂質(zhì)發(fā)生過氧化，并促進(jìn)H2O2分解為無毒害作用的H2O，保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能[10]。超氧化物歧化酶(SOD)作為清除活性氧的主要酶類，可直接反映細(xì)胞的抗氧化能力。SOD能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子和氫離子發(fā)生反應(yīng)，生成O2和H2O2，其中H2O2在GSH-Px的作用下可分解成O2和H2O，從而有效抵抗氧化應(yīng)激損傷[11]。

Fig 4 Effect of astragaloside Ⅳ on autophagic fluorescent spots of PC12 cells n=6)

Fig 5 Effect of astragaloside Ⅳ on Beclin1 protein expression of PC12 n=6)

自噬是真核生物細(xì)胞在不斷進(jìn)化過程中的一種高度保守的重要分解代謝過程。為實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身代謝需要和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，細(xì)胞內(nèi)脫落的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜或高爾基體膜可將老化、受損或異常的生物大分子和細(xì)胞器包裹，形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體，最終在溶酶體的降解作用下，產(chǎn)生新的能量物質(zhì)，供細(xì)胞循環(huán)再利用。

由于被降解的生物大分子和細(xì)胞器轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體的方式不同，可將自噬分為3種類型：微自噬、巨自噬、分子伴侶介導(dǎo)的自噬，而巨自噬目前研究最為廣泛和深入。細(xì)胞自噬受多種自噬相關(guān)基因的調(diào)控，其中Beclin1基因是調(diào)控自噬的特異性基因。Beclin1基因亦稱為BECN1基因，是酵母菌ATG6基因在哺乳類生物中的同系物，有4個(gè)結(jié)構(gòu)域：BH3結(jié)構(gòu)域、進(jìn)化保守結(jié)構(gòu)域、卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域、核輸出結(jié)構(gòu)域。Beclin1基因可通過這些結(jié)構(gòu)域形成相應(yīng)復(fù)合體，誘導(dǎo)其他自噬基因定位在自噬體膜，調(diào)控自噬小體的形成，介導(dǎo)自噬活動(dòng)。因此，Beclin1基因和自噬小體常作為檢測(cè)自噬活動(dòng)的重要依據(jù)。大量研究證實(shí)，腦缺血/再灌注可誘導(dǎo)Beclin1表達(dá)增多，促進(jìn)自噬小體形成；應(yīng)用自噬抑制劑3-MA處理后，Beclin1表達(dá)減少，自噬小體數(shù)量減少，神經(jīng)元存活率升高，提示自噬可拮抗腦缺血/再灌注損傷[12-13]。

中藥黃芪最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，有補(bǔ)氣藥中“耆長(zhǎng)”、“補(bǔ)氣諸藥之最”的美譽(yù)，收錄于歷版《中華人民共和國(guó)藥典》和全國(guó)統(tǒng)編《中藥學(xué)》規(guī)劃教材。大量文獻(xiàn)記載，黃芪不僅具有補(bǔ)氣的功效，還具有活血化瘀、通絡(luò)止痛的作用，在治療缺血性腦血管病方面效果良好，應(yīng)用廣泛。中國(guó)中藥化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)顯示，黃芪的化學(xué)成分包括黃芪皂苷、黃芪黃酮、黃芪多糖、氨基酸、微量元素等70余種有效物質(zhì)成分。黃芪甲苷是黃芪皂苷中的代表性活性單體成分，具有抗炎、抗衰老、抗凋亡、抗病毒、促進(jìn)能量代謝和干細(xì)胞增殖等生物作用，是檢測(cè)黃芪質(zhì)量?jī)?yōu)劣的重要參考指標(biāo)[14-15]。本課題組一直致力于黃芪及其有效成分防治缺血性腦血管病方面的研究。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可通過上調(diào)自噬抑制腦缺血/再灌注損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，但其作用機(jī)制尚未完全闡明，亟待明確。本實(shí)驗(yàn)以PC12細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖模型模擬建立神經(jīng)元體外缺血/再灌注損傷，在細(xì)胞水平，從調(diào)控自噬和氧化應(yīng)激角度，探討黃芪甲苷拮抗腦缺血/再灌注損傷的具體作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖可誘導(dǎo)自噬激活，同時(shí)也引起了氧化應(yīng)激損傷；當(dāng)黃芪甲苷干預(yù)后，自噬活動(dòng)增強(qiáng)，氧化應(yīng)激損傷減輕，提示黃芪甲苷可上調(diào)自噬，并抑制氧化應(yīng)激損傷；當(dāng)自噬抑制劑3-MA、黃芪甲苷同時(shí)干預(yù)，自噬活動(dòng)變?nèi)?，氧化?yīng)激損傷加重，表明黃芪甲苷可通過上調(diào)自噬，減輕氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，發(fā)揮保護(hù)作用。

最后，需要指出的是，自噬具有“雙刃劍”的作用，自噬過度激活可引起自噬性細(xì)胞損傷甚至死亡，這可能與疾病的發(fā)展過程、損傷程度、干預(yù)條件、預(yù)后轉(zhuǎn)歸等因素有關(guān)，因此如何更加全面地認(rèn)識(shí)自噬，精準(zhǔn)地調(diào)節(jié)自噬，充分發(fā)揮其保護(hù)作用，將是我們進(jìn)一步努力和探索的方向。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，謝謝！)