陳靜坤，葉展超，鄭曉輝，張錦雀

(1. 廈門大學附屬中山醫(yī)院口腔科，福建 廈門 361000；2. 廈門醫(yī)學院機能與臨床轉(zhuǎn)化福建省高校重點實驗室，福建 廈門 361023；3. 福建醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院，福建 福州 351004)

黏附調(diào)節(jié)分子1(adhesion regulating molecule 1，ADRM1)亦被稱為 hRpnl3(human Rpn13)，是26S蛋白酶體亞單位19S調(diào)節(jié)顆粒上的主要泛素受體之一，決定26S蛋白酶體結(jié)構(gòu)不對稱性。ADRM1介導的蛋白酶體泛素化路徑介導NF-κB、TGF-βI型受體、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)等底物蛋白降解[1]。研究表明[2-5]，ADRM1在結(jié)腸癌、肺癌、腎癌、肝癌等多種實體瘤和急性白血病中均處于過表達狀態(tài)，下調(diào) ADRM1蛋白表達可明顯促進癌細胞凋亡。 因此，ADRM1可能成為腫瘤治療靶點。有研究表明[2, 6-11]，雙亞芐基哌啶RA190可與ADRM1的半胱氨酸88共價結(jié)合，快速觸發(fā)多泛素蛋白累積，誘導對硼替佐米耐藥的多發(fā)性骨髓瘤細胞凋亡，也抑制卵巢癌、肝癌、肝內(nèi)膽管癌等多種腫瘤細胞增殖；也有大量研究報道蛋白酶體抑制劑MG132通過抑制泛素蛋白酶體途徑活性，誘導肺癌[12]、Burkitt淋巴瘤[13]、急性髓系白血病[4]、肝癌、結(jié)直腸癌[14]等癌細胞凋亡；協(xié)同全反式維甲酸誘導GTF2I-RARA融合基因陽性的HL60細胞分化[15]。

那么，RA190與MG132在舌癌細胞中作用效果如何呢？本實驗擬通過觀察舌癌細胞株CAL27和TCA8113在RA190或MG132藥物作用下存活率變化及周期與凋亡情況，比較這兩種藥物對舌癌細胞的毒性作用及作用機制，為臨床治療舌癌藥物選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 舌癌細胞株CAL27、TCA8113為福建醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院饋贈。

1.1.2試劑 MG132(Cat. No. HY-13259)結(jié)構(gòu)見Fig 1、RA190(Cat. No. HY-100739)結(jié)構(gòu)見Fig 2、CCK8(Cat. No. MA0218)(MCE，中國)，ADRM1(Cat. No.12019)、Cyclin B1(Cat. No.12231)、Bak(Cat. No.6947)、Bax(Cat. No. 5023)蛋白Western blot用一抗體(CST，美國)，DMEM、D-hanks、PBS(Corning，美國)，胰酶(Gibigo，美國)，胎牛血清(Cat. No.900-108，Gemini，南美)，PI(KeyGEN Biotech，中國)；Annexin V FLUOS Staining Kit(Cat. No. 11858777001，Roche，德國)。

Fig 1 Chemical structure of RA190

Fig 2 Chemical structure of MG132

1.1.3儀器 二氧化碳細胞培養(yǎng)箱2323-2(SHELLAB公司)；倒置顯微鏡37XA(上海光學儀器廠)；酶標儀(Bio-rad公司)；流式細胞儀EPICSXL(貝克曼庫爾特公司)；電泳儀PowerPac HC(Bio-Rad公司)；快速Western blot儀器MA01821(Millipore)；垂直電泳槽VE-180(上海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞增殖/毒性實驗 設(shè)(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μmol·L-1)不同濃度RA190或MG132實驗組、對照組(無藥)和空白組(不含細胞)。在96孔板中接種100 μL細胞懸液(細胞濃度2×108·L-1)，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱預培養(yǎng)24 h；吸棄培養(yǎng)基，向每孔加入100 μL含不同濃度RA190或MG132的完全培養(yǎng)基，孵育24h；每孔加入10 μL CCK-8 ，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h；用酶標儀測定在450/630 nm處的吸光度。繪制曲線。

1.2.2流式細胞術(shù)檢測細胞周期 6孔板中接種2 mL細胞懸液(細胞濃度5×108·L-1)，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱預培養(yǎng)24 h；吸棄培養(yǎng)基，向每孔加入2 mL含不同濃度RA190或MG132的完全培養(yǎng)基，孵育24h后，收集細胞于5 mL PBS中，800 r·min-1離心5 min， 棄上清，預冷的PBS洗2次，300 μL預冷的PBS重懸沉淀后，吸取700 μL預冷的無水乙醇逐滴滴入重懸液中，置-20℃固定過夜，之后按PI說明書操作。

1.2.3Annexin V FLUOS Staining Kit流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 用Annexin V FLUOS Staining Kit檢測細胞凋亡率。細胞加藥及收集步驟同“1.2.2”，之后按說明書操作。

1.2.4Western blot檢測細胞內(nèi)蛋白表達 細胞加藥培養(yǎng)步驟同“1.2.2”，收集各組細胞，PBS洗2次，加入RIPA細胞裂解液(含1 mmol·L-1PMSF、1 mmol·L-1正釩酸鈉、10 mg·L-1抑肽酶)提取總蛋白，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，取40 μg總蛋白進行Western blot實驗。10% SDS-PAGE電泳后，行轉(zhuǎn)膜印跡，分別用β-actin、ADRM1、Cyclin B1、Bax、Bak一抗體與膜上的抗原結(jié)合，然后用HRP偶聯(lián)的二抗與其反應，用ECL化學發(fā)光試劑檢測，經(jīng)壓片曝光后，顯影和定影。比較各組蛋白表達情況。設(shè)2個復孔，不同時間獨立重復3次。

2 結(jié)果

2.1 RA190或MG132對舌癌細胞存活率的影響以細胞濃度2×108·L-1種板，CCK-8法酶標儀檢測RA190或MG132 (0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μmol·L-1)作用24 h后舌癌細胞CAL27、TCA8113的OD450/630值。設(shè)3個復孔，不同時間獨立重復3次。如Fig 3所示，隨著MG132濃度提高，CAL27、TCA8113細胞活力下降，半抑制濃度IC50分別約為0.1和0.3 μmol·L-1；其中，當MG132濃度在0.2～1.6 μmol·L-1期間TCA8113細胞活力曲線處在平緩階段，說明這期間MG132對TCA8113細胞毒性作用變化不大。RA190對CAL27、TCA8113細胞的IC50分別約為0.18和1.6 μmol·L-1；RA190濃度在0.2～0.8 μmol·L-1期間CAL27細胞活力曲線平緩，在0.8 μmol·L-1之后活力曲線處于平臺階段，說明部分CAL27細胞對RA190耐藥；RA190濃度為0.8 μmol·L-1左右TCA8113細胞活力才開始下降，說明RA190需要在較大的濃度下才對TCA8113細胞產(chǎn)生毒性作用。

Fig 3 Cell viability of CAL27 and TCA8113 cells treated with different RA190 or MG132 concentrations for 24 h

2.2 RA190、MG132對舌癌細胞周期作用細胞以5×108·L-1接種6孔板2 mL，設(shè)0.5、1 μmol·L-1RA190或MG132實驗組和對照組，各組2個復孔，流式細胞術(shù)檢測各組細胞周期變化，獨立重復實驗3次。如Fig 4、Tab 1所示，0.5、1 μmol·L-1RA190(R0.5， R1)均誘導CAL27細胞G1/G0期停滯，對TCA8113周期無影響；1 μmol·L-1RA190也誘導CAL27細胞G2/M期停滯；0.5、1 μmol·L-1MG132(M0.5，M1)均誘導CAL27細胞G2/M期停滯，對TCA8113周期無影響。

Fig 4 Cycle of CAL27 and TCA8113 cells treated with different concentrations of RA190 or MG132 for 24 h n=3)

2.3 RA190、MG132對舌癌細胞凋亡影響細胞以5×108·L-1接種6孔板2 mL，設(shè)0.5、1 μmol·L-1RA190或MG132實驗組和對照組，各組2個復孔，流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡，獨立重復實驗2次。如Fig 5、Tab 2所示，在0.3、0.5、1 μmol·L-1MG132作用下，CAL27與TCA8113細胞早期與晚期凋亡率均提高(P<0.05)，并與劑量呈線性關(guān)系；0.5、1 μmol·L-1RA190均對CAL27凋亡無影響，1 μmol·L-1RA190提高TCA8113細胞早期與晚期凋亡率[(4±1)%，(5.97±0.86)%；P<0.05)]。

Fig 5 Apoptosis of TCA8113 cells treated with 1 μmol·L-1 RA190 or MG132 for 24 n=3)

2.4 RA190、MG132對舌癌細胞內(nèi)ADRM1、Cyclin B1、Bax、Bak蛋白表達的影響為探討RA190與MG132對舌癌細胞的毒性作用與ADRM1的相關(guān)性及兩藥作用機制差異性，本實驗采用Western blot檢測 0.5、1 、2 μmol·L-1RA190或MG132(R0.5，R1，R2；M0.5，M1，M2)作用24 h后，舌癌細胞內(nèi)ADRM1、Cyclin B1、Bax、Bak蛋白表達變化。如Fig 6所示，TCA8113細胞內(nèi)ADRM1蛋白水平顯著低于CAL27細胞(P<0.05)；隨著RA190或MG132藥物濃度提高，Cyclin B1蛋白表達上調(diào)(P<0.05)，ADRM1、Bax、Bak蛋白表達下調(diào)(P<0.05)；TCA8113細胞在1 μmol·L-1RA190作用下ADRM1、Bak、Cyclin B1蛋白表達差異不大，而在相同濃度MG132作用下，Bax表達下調(diào)、Cyclin B1表達上調(diào)。

Tab 1 Cycle of CAL27 and TCA8113 cells treated with different concentrations of RA190 or MG132 for 24 h n=3)

Tab 2 Apoptosis of CAL27 and TCA8113 cells treated with different concentrations of RA190 or MG132 for 24 h n=3)

Fig 6 Expression of ADRM1, Cyclin B1, Bax and Bak protein in CAL27 and TCA8113 cells treated with different concentrations of RA190 or MG132 for 24 h n=3)

3 討論

實驗中，本課題組發(fā)現(xiàn)，TCA8113細胞種板24 h后，有大量懸浮細胞，這些細胞經(jīng)臺盼藍染色觀察，活率達75%；吸取懸浮細胞種板，大量細胞仍可貼壁。因此，藥物對舌癌細胞的毒性觀察應包含這部分懸浮細胞。綜合Fig3～5結(jié)果：①RA190組：RA190引起CAL27細胞活力下降，對CAL27細胞凋亡無作用，提示RA190可能主要通過阻滯CAL27細胞于G0/G1或G2/M期引起細胞活力下降；相反，RA190對TCA8113周期無顯著影響，但在0.8 μmol·L-1之后通過促凋亡作用對TCA8113細胞產(chǎn)生毒性作用；RA190作用下舌癌細胞活力曲線中間部分較為平緩，可能是貼壁細胞對RA190較不敏感。這提示RA190在舌癌中作用具有很大的選擇性和局限性。② MG132組： MG132誘導CAL27細胞G2/M期停滯，對TCA8113細胞無影響；MG132明顯提高CAL27與TCA8113細胞早期與晚期凋亡率，說明MG132主要通過促進細胞凋亡引起舌癌細胞活力下降；MG132可影響CAL27周期和凋亡，這導致MG132對CAL27細胞毒性作用強于TCA8113細胞。

在哺乳動物細胞中，Cyclin B從G1期晚期開始表達并逐漸積累，到G2期后期階段達到最大值并一直維持到M期的中期階段，然后迅速降解。CAL27細胞在RA190或MG132作用下G2期阻滯，此時細胞內(nèi)Cyclin B1蛋白表達上調(diào)，兩者結(jié)果一致。

Bak、Bax是人體重要促凋亡分子，下調(diào)Bax、Bak蛋白表達，可能抑制細胞凋亡，從而提高細胞存活率。但本實驗中MG132明顯促進CAL27細胞凋亡，此時Bax、Bak蛋白表達減少，兩者存在矛盾。這可能是MG132促CAL27細胞凋亡時，細胞內(nèi)存在負反饋調(diào)節(jié)；也可能提示MG132對CAL27細胞促凋亡作用存在其他機制，具體有待進一步研究。這為后續(xù)實驗提供新思考。

MG132與RA190明顯下調(diào)CAL27內(nèi)ADRM1蛋白表達，但RA190對該細胞凋亡無明顯作用，提示ADRM1不是影響舌癌發(fā)生發(fā)展的癌基因。同時，RA190下調(diào)CAL27內(nèi)ADRM1蛋白表達，與其濃度呈線性關(guān)系，而MG132則不存在這種線性關(guān)系，這說明ADRM1介導的蛋白酶體泛素化路徑不是MG132在舌癌細胞中的主要作用途徑；MG132在舌癌中存在其他重要作用通路，具體有待進一步研究。另外，MG132明顯促進CAL27細胞凋亡，具有明顯毒性作用，可能用于舌癌治療，但由于其作用靶點不單一，因此可能存在較多的副作用。

綜上，本研究認為靶向ADRM1藥物RA190僅適用于ADRM1高表達舌癌治療，但其IC50濃度相對MG132較高，用于舌癌治療可能并不理想；本研究同時也為舌癌臨床采用蛋白酶體抑制劑策略奠定基礎(chǔ)。