呂 婷，楊淑婷，陸 苑，鞏仔鵬，李勇軍，曹 闖，王永林 *

1貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2貴州醫(yī)科大學(xué) 民族藥與中藥開(kāi)發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心；3貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴陽(yáng) 550004

羊耳菊為菊科植物羊耳菊(InulacappaDC.)的新鮮或干燥全草。主治疏風(fēng)散熱，解毒消腫。用于感冒發(fā)熱，咽喉腫痛，風(fēng)濕疼痛，癰瘡疔毒，乳癰[1]。國(guó)內(nèi)已有文獻(xiàn)報(bào)道了羊耳菊藥材的主要成分是黃酮類、酚酸類、香豆素和揮發(fā)油等[2- 5]，對(duì)羊耳菊提取物的抗菌抗炎活性的研究發(fā)現(xiàn)，羊耳菊提取物能夠有效的抑制金黃色葡萄球菌，并有效抑制細(xì)胞釋放NO產(chǎn)生抗炎作用[6,7]。課題組前期對(duì)羊耳菊進(jìn)行了大量研究，確定羊耳菊活性部位為60%乙醇提取，用60%乙醇經(jīng)D101型大孔樹(shù)脂吸附洗脫得到；通過(guò)相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)確定了多批提取物中7個(gè)峰面積比較大的共有峰，分別為酚酸類4，5- 二咖啡?；鼘幩?、新綠原酸、綠原酸、3，4- 二咖啡?；鼘幩?、1，3- 二咖啡酰基奎寧酸、隱綠原酸，以及黃酮類木犀草苷，并對(duì)羊耳菊提取物不同模型的腸吸收以及代謝物的分析進(jìn)行了研究[9- 11]。

藥物經(jīng)胃腸道被吸收進(jìn)入機(jī)體后，通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)送達(dá)各個(gè)組織器官，藥物組織分布的特點(diǎn)除了與藥物本身的理化性質(zhì)有關(guān)，還與藥物和組織的親和力等因素有密切的關(guān)系。因此，了解藥物在組織的分布對(duì)新藥的開(kāi)發(fā)有重要意義[8]。國(guó)內(nèi)外已有文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)綠原酸、木樨草甘等在體內(nèi)的組織分布情況[12,13]，其主要分布組織和達(dá)到峰值的時(shí)間并不相同。本實(shí)驗(yàn)在建立UPLC- MS /MS 同時(shí)測(cè)定大鼠組織中7個(gè)代表成分含量的基礎(chǔ)上，研究大鼠灌胃羊耳菊提取物后這7個(gè)代表成分(化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示)在大鼠體內(nèi)的組織分布，探討羊耳菊提取物在大鼠體內(nèi)的分布特征，為羊耳菊提取物的深度開(kāi)發(fā)和臨床準(zhǔn)確、安全及合理用藥提供參考。

1 材料

1.1 儀器

超高液相色譜- 三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Waters公司)；MTN- 2800D型氮吹濃縮裝置(天津奧特塞恩斯儀器有限公司)；Allegra 64R低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司)；可調(diào)高速勻漿機(jī)(FSH- 2A普瑞斯機(jī)械有限公司)。

圖1 七個(gè)指標(biāo)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of seven index components

1.2 藥物與試劑

葛根素、木犀草苷、綠原酸(批號(hào)：110752- 201514、111720- 201408、110753- 201415)購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，新綠原酸、隱綠原酸、1，3- 二咖啡酰基奎寧酸、3，4- 二咖啡?；鼘幩岷?，5- 二咖啡酰基奎寧酸(批號(hào)：X20- 20141012、Y58- 20141012、1384- 101215、1384- 101215、1384- 101215)均購(gòu)于中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心；羊耳菊活性部位(自制，批號(hào)：20150316)；Cyclosporin A(Biotopped，批號(hào)：201412)；羊耳菊藥材購(gòu)自貴州龍里縣，由貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室龍慶德副教授鑒定為菊科植物羊耳菊Inulacappa(Buch.Ham.exD.Don)DC.的干燥全草。

1.3 動(dòng)物

健康SD大鼠24只，♀♂兼用，體質(zhì)量為250±20 g，由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK(渝)2015- 0001。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18(2.1×50 mm，1.7 μm)；進(jìn)樣量：2 μL；柱溫：45 ℃；流動(dòng)相A：0.1%甲酸乙腈；流動(dòng)相B：0.1%甲酸水；流速：0.25 mL/min；梯度洗脫程序：0 min～0.5 min用5% A；0.5 min～1 min用5%～15%A；1 min～3.8 min用15%～18%A；3.8 ～4.0 min用18%～90%A；4.0～5.0 min用90%～5%A。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源(ESI)；去溶劑氣(氮?dú)?00 L/h)，去溶劑氣溫度(550 ℃)，碰撞氣(氬氣，50 L/hr)，掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式(MRM)，檢測(cè)離子為4，5- 二咖啡?；鼘幩醡/z515.29～173.08，新綠原酸m/z353.15～191.03，綠原酸m/z353.17～191.04，3，4- 二咖啡酰基奎寧酸m/z515.27～353.15，1，3- 二咖啡?；鼘幩醡/z515.29～353.16，隱綠原酸m/z353.21～173.08，木樨草甘m/z447.29～2875.02，內(nèi)標(biāo)物葛根素m/z417.16～297.07，錐孔電壓分別為35、25、25、25、35、35、25、30 V，碰撞電壓分別為25、15、15、15、17、17、15、15 eV。

2.3 溶液的配制

內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱取葛根素5.7 mg，置于5 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得濃度為1.14 mg/mL的葛根素儲(chǔ)備液。精密吸取適量?jī)?chǔ)備液逐級(jí)稀釋至濃度為4 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

對(duì)照品溶液：分別精密稱取4，5- 二咖啡?；鼘幩?5.08 mg)、新綠原酸(5.37 mg)、綠原酸(5.17 mg)、3，4- 二咖啡?；鼘幩?5.11 mg)、1，3- 二咖啡?；鼘幩?5.10 mg)、隱綠原酸(5.10 mg)對(duì)照品，分別置于5 mL棕色容量瓶中，加甲醇分別溶解并稀釋至刻度；另精密稱取木犀草苷(5.11 mg)對(duì)照品，置于5 mL棕色容量瓶中，加75%乙醇溶解并稀釋至刻度。分別得到濃度為1.02 mg/mL(4，5- 二咖啡?；鼘幩?、1.07 mg/mL(新綠原酸)、1.03 mg/mL(綠原酸)、1.02 mg/mL(3，4- 二咖啡?；鼘幩?、1.02 mg/mL(1，3- 二咖啡?；鼘幩?、1.02 mg/mL(隱綠原酸)、1.03 mg/mL(木犀草苷)的對(duì)照品儲(chǔ)備液。置于冰箱- 20 ℃保存，備用。分別精密吸取7種對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇逐級(jí)稀釋至系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.4 組織樣品收集

健康SD大鼠24只，雄性，體重(230±20)g，給藥前12小時(shí)禁食，自由飲水。隨機(jī)分為4組(空白對(duì)照組、0.5 h組、1.5 h組、5 h組，每組6只)，按照10 mL/kg灌服羊耳菊有效組分提取物(給藥劑量為100 g/kg生藥量)分別于次日灌胃給以羊耳菊提取物前、給藥后0.5、1.5、5 h取出各臟器組織，相應(yīng)的心、肝、脾、肺、腎、小腸、腦、骨骼肌、胃，用0.9% NaCl溶液洗去表面浮血，濾紙吸干，精密稱取各組織0.5 g，并用生理鹽水制成25%勻漿，組織勻漿液超聲5 min后，5 000 rpm離心10 min，分離上清液于- 80℃冰箱儲(chǔ)存，待處理。

2.5 組織樣品處理

取上述組織勻漿上層液300 μL，置于1.5 mL離心管中，加入20%甲酸水60 μL，渦混，加入內(nèi)標(biāo)溶液20 μL(葛根素4.56 μg/mL)，渦混后加入900 μL甲醇沉淀蛋白，渦混5 min，60 HZ超聲5 min，10 000 rpm離心6 min，取上清液用氮吹儀在40 ℃下吹干，殘?jiān)?00 μL 50% 甲醇水復(fù)溶，渦混3 min，超聲3 min，10 000 rpm離心10 min，取上清液進(jìn)UPLC- MS/MS分析。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證

方法學(xué)結(jié)果表明，以小腸組織為例，典型色譜結(jié)果見(jiàn)圖2，組織中所含內(nèi)源性物質(zhì)不干擾被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物的測(cè)定，分離度高，被測(cè)物峰型好，提示該方法專屬性良好；7種指標(biāo)成分在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r均大于0.99，各成分的定量限分別為4，5- 二咖啡酰基奎寧酸17.21 ng/mL、新綠原酸18.19 ng/mL、綠原酸17.51 ng/mL、3，4- 二咖啡?；鼘幩?7.31 ng/mL、1，3- 二咖啡?；鼘幩?7.27 ng/mL、隱綠原酸17.27 ng/mL、木犀草苷17.31 ng/mL；各成分的檢出限分為4，5- 二咖啡?；鼘幩?.74 ng/mL、新綠原酸6.06 ng/mL、綠原酸5.84 ng/mL、3，4- 二咖啡?；鼘幩?.77 ng/mL、1，3- 二咖啡?；鼘幩?.76 ng/mL、隱綠原酸5.76 ng/mL、木犀草苷5.77 ng/mL；在各組織勻漿液中的日內(nèi)和日間精密度RSD值均小于15%，準(zhǔn)確度范圍為90%～110%，提示該方法準(zhǔn)確度、精密度良好，符合生物樣品分析方法要求；各組織中提取回收率良好，不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)，均符合生物樣品分析方法要求；各組織樣品在自動(dòng)進(jìn)樣器中放置6 h和反復(fù)凍融3次后，樣品中7個(gè)成分的峰面積偏差均在15%以內(nèi)，表明各組織勻漿液中待測(cè)物在自動(dòng)進(jìn)樣器中放置6 h和反復(fù)凍融3次后的穩(wěn)定性良好。

圖2 典型UPLC- MS/MS圖譜Fig.2 Typical UPLC- MS/MS chromatogram 注：A.空白小腸樣品；B.空白小腸加對(duì)照品溶液；C.0.5h小腸樣品；1.綠原酸，2.新綠原酸，3.隱綠原酸，4.葛根素，5.1，3- 二咖啡?；鼘幩?，6.木犀草苷，7.3，4- 二咖啡酰基奎寧酸，8.4，5- 二咖啡酰基奎寧酸。Note：A.blank small intestine sample;B.blank small intestine plus control solution;C.small intestine sample under 0.5h;1.chlorogenic acid,2.neochlorogenic acid,3.cryptochlorogenic acid,4.puerarin,5.1,3- two caffeoyl quinic acid,6.galuteolin,7.3,4- two caffeoyl quinic acid,8.4,5- two caffeoyl quinic acid.

3.2 組織分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按照“2.5”項(xiàng)下處理各組織樣品，照“2.2”項(xiàng)下分析條件進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算給藥后大鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎、腦、小腸、肌肉和胃組織中7種成分的濃度，結(jié)果以每1 g 組織含有被測(cè)成分的量(ng)表示。

3.2.1 羊耳菊活性部位中新綠原酸的組織分布

羊耳菊活性部位中新綠原酸的組織分布結(jié)果見(jiàn)表1所示：新綠原酸不同時(shí)間下在心、肝、脾、肺、腎、小腸、肌、胃中均有分布，其中在胃腸道分布較多，其他組織較少，腦組織未檢測(cè)到。不同組織中的含量(ng/g)在0.5 h時(shí)分別為小腸>胃>腎>肌>肺>脾>心>肝；在1.5 h時(shí)分別為胃>小腸>腎>肌>脾>心>肺>肝；在5 h時(shí)分別為胃>腎>肌>脾>心>肺。

表1 不同時(shí)間下新綠原酸在各組織中的分布(Mean±SD，n = 6)

注：“NA”表示低于檢出限，“- ”表示低于檢測(cè)限。

Note：“NA” is below LLOD,“- ” is below LLOQ.

3.2.2 羊耳菊活性部位中綠原酸的組織分布

羊耳菊活性部位中綠原酸的組織分布結(jié)果見(jiàn)表2所示：綠原酸不同時(shí)間下在心、肝、脾、肺、腎、小腸、肌、胃中均有分布，其中在胃腸道分布較多，其他組織較少，腦組織中未檢測(cè)到。不同組織中的含量(ng/g)在0.5 h時(shí)分別為小腸>胃>腎>心>肌>脾>肺；在1.5 h時(shí)分別為胃>小腸>腎>肌>肝>脾>心>肺；在5 h時(shí)分別為胃>腎>肌>脾>肺。

表2 不同時(shí)間下綠原酸在各組織中的分布(Mean±SD，n= 6)

注：“NA”表示低于檢出限，“- ”表示低于檢測(cè)限。

Note：“NA” is below LLOD,“- ” is below LLOQ.

3.2.3 羊耳菊活性部位中隱綠原酸的組織分布

羊耳菊活性部位中隱綠原酸的組織分布結(jié)果見(jiàn)表3所示：隱綠原酸不同時(shí)間下在心、肝、脾、肺、腎、小腸、肌、胃中均有分布，其中在胃腸道分布較多，其他組織較少，腦組織中未檢測(cè)到。不同組織中的含量(ng/g)在0.5 h時(shí)分別為小腸>胃>腎>脾>肝>肺>肌>心；在1.5 h時(shí)分別為胃>小腸>腎>肝>肌>脾>肺>心；在5 h時(shí)分別為胃>腎>肌>脾>肺>肝。

表3 不同時(shí)間隱綠原酸在各組織中的分布(Mean±SD，n = 6)

注：“NA”表示低于檢出限，“- ”表示低于檢測(cè)限。

Note：“NA” is below LLOD,“- ” is below LLOQ.

3.2.4 羊耳菊活性部位中1，3- 二咖啡?；鼘幩岬慕M織分布

羊耳菊活性部位中1，3- 二咖啡酰基奎寧酸的組織分布結(jié)果見(jiàn)表4所示：1，3- 二咖啡?；鼘幩岵煌瑫r(shí)間下在心、肝、脾、肺、腎、小腸、肌、胃中均有分布，其中在胃腸道分布較多，其他組織較少，腦組織中未檢測(cè)到。不同組織中的含量(ng/g)在0.5 h時(shí)分別為小腸>胃>腎>心>肝>肌>脾>肺；在1.5 h時(shí)分別為胃>小腸>腎>肝>肌>脾>心>肺；在5 h時(shí)分別為胃>腎>肌>脾>肺>心。

表4 不同時(shí)間下1，3- 二咖啡?；鼘幩嵩诟鹘M織中的分布(Mean±SD，n = 6)

注：“NA”表示低于檢出限，“- ”表示低于檢測(cè)限。

Note：“NA” is below LLOD,“- ” is below LLOQ.

3.2.5 羊耳菊活性部位中3，4- 二咖啡?；鼘幩岬慕M織分布

羊耳菊活性部位中3，4- 二咖啡?；鼘幩岬慕M織分布結(jié)果見(jiàn)表5所示：3，4- 二咖啡?；鼘幩岵煌瑫r(shí)間下在心、肝、脾、肺、腎、小腸、肌、胃中均有分布，其中在胃腸道分布較多，其他組織較少，腦組織中未檢測(cè)到。不同組織中的含量(ng/g)在0.5 h時(shí)分別為小腸>胃>腎>肌>肝>脾>心>肺；在1.5 h時(shí)分別為胃>腎>小腸>肝>肌>脾>心>肺；在5 h時(shí)分別為胃>腎>肌>心>肺>脾。

表5 不同時(shí)間下3，4- 二咖啡?；鼘幩嵩诟鹘M織中的分布(Mean±SD，n = 6)

注：“NA”表示低于檢出限，“- ”表示低于檢測(cè)限。

Note：“NA” is below LLOD,“- ” is below LLOQ.

3.2.6 羊耳菊活性部位中4，5- 二咖啡酰基奎寧酸的組織分布

羊耳菊活性部位中4，5- 二咖啡?；鼘幩岬慕M織分布結(jié)果見(jiàn)表6所示：4，5- 二咖啡?；鼘幩岵煌瑫r(shí)間下在心、肝、脾、肺、腎、小腸、肌、胃中均有分布，其中在胃腸道分布較多，其他組織較少，腦組織中未檢測(cè)到。不同組織中的含量(ng/g)在0.5 h時(shí)分別為小腸>胃>腎>心>肝>肌>脾；在1.5 h時(shí)分別為胃>腎>肝>心>肌>脾>肺>小腸；在5 h時(shí)分別為腎>胃>心>肌>肺>肝。

表6 不同時(shí)間4，5- 二咖啡?；鼘幩嵩诟鹘M織中的分布(Mean±SD，n = 6)

注：“NA”表示低于檢出限，“- ”表示低于檢測(cè)限。

Note：“NA” is below LLOD,“- ” is below LLOQ.

3.2.7 羊耳菊活性部位中木犀草苷的組織分布

羊耳菊活性部位中木犀草苷的組織分布結(jié)果見(jiàn)表7所示：木犀草苷不同時(shí)間下在心、肝、脾、肺、腎、肌、胃中均有分布，其中在胃分布較多，其他組織較少，小腸與腦組織中未檢測(cè)到。不同組織中的含量(ng/g)在0.5 h時(shí)分別為胃>小腸>心>腎>肝>脾；在1.5 h時(shí)分別為胃>肝>心>脾>腎>小腸>肺；在5 h時(shí)分別為心>腎>胃>脾>肺。

表7 不同時(shí)間木犀草苷在各組織中的分布(Mean±SD，n = 6)

續(xù)表7(Continued Tab.7)

組織Tissue 0.5 h(ng/g)1.5 h(ng/g)5 h(ng/g)肺 Lung-17.87±1.3918.79±1.75腎 Kidney42.22±4.2143.30±2.7650.59±6.72腦 BrainNANANA小腸Small intestien163.64±42.1118.31±4.76-肌 Muscle---胃 Stomach686.24±80.241 614.64±83.2625.92±8.66

注：“NA”表示低于檢出限，“- ”表示低于檢測(cè)限。

Note：“NA” is below LLOD,“- ” is below LLOQ.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠灌胃給以羊耳菊活性部位提取物后，7種成分的吸收、分布、清除較為迅速，各指標(biāo)成分在體內(nèi)無(wú)蓄積情況。在給藥30 min內(nèi)，均在小腸內(nèi)迅速達(dá)到峰濃度，給藥1.5 h后，7種成分均在脾、胃等組織分布較快。

4 討論

本研究采用UPLC- MS/MS建立了同時(shí)測(cè)定羊耳菊活性部位中7種指標(biāo)成分(新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、1，3- 二咖啡?；鼘幩帷?，4- 二咖啡酰基奎寧酸、4，5- 二咖啡酰基奎寧酸、木犀草苷)在大鼠體內(nèi)組織分布的分析方法，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法簡(jiǎn)便快速，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，分析效率高，適合高通量的生物樣品分析。

據(jù)報(bào)道，綠原酸及其類似物的吸收主要在小腸和結(jié)腸，在微生物的作用下轉(zhuǎn)化成多種代謝產(chǎn)物[14]。在本實(shí)驗(yàn)中，0.5 h時(shí)綠原酸、新綠原酸，隱綠原酸、1，3- 二咖啡?；鼘幩?、3，4- 二咖啡酰基奎寧酸和4，5- 二咖啡酰基奎寧酸在小腸的濃度最高，證明口服羊耳菊提取物后，6種成分的主要吸收部位在小腸。1.5 h時(shí)，小腸內(nèi)的濃度明顯降低，這可能是因?yàn)榫G原酸類活性物質(zhì)容易被腸道菌群水解，發(fā)生酯基位置異構(gòu)和脫羥基等反應(yīng)[15]，從而導(dǎo)致此類化合物的濃度明顯降低。而在5 h時(shí)，6種成分在小腸的含量均低于定量限，證明此時(shí)6種成分在小腸內(nèi)幾乎消除完畢。與此同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了羊耳菊灌胃后的藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)，后主要的藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)如表8所示。

表8 7種成分在正常大鼠血漿中的主要藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)(Mean±SD，n = 6)

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，7種成分主要分布在胃、小腸和腎組織中，對(duì)腎臟表現(xiàn)出較強(qiáng)的親和力，推測(cè)腎臟可能是羊耳菊提取物的主要排泄器官之一；木犀草苷在肌肉組織中含量較低，說(shuō)明其吸收入血后迅速分布于其他組織，對(duì)肌肉組織親和力較差；同時(shí)腦組織中未檢測(cè)到該7種成分，但已有文獻(xiàn)[12,13]報(bào)道過(guò)綠原酸和木樨草甘能夠入腦，本次實(shí)驗(yàn)在腦組織中未檢測(cè)出該7種成分，原因是含量低于最低定量限，無(wú)法做定量分析；同時(shí)，本次實(shí)驗(yàn)中，綠原酸、新綠原酸，隱綠原酸、1，3- 二咖啡?；鼘幩帷?，4- 二咖啡?；鼘幩岷?，5- 二咖啡?；鼘幩?個(gè)酚酸類成分除小腸與胃兩個(gè)吸收部位外，主要分布組織為腎臟，這與文獻(xiàn)[16,17]報(bào)道的一致；6種酚酸類成分在0.5 h時(shí)在腎臟濃度達(dá)到峰值，之后的濃度逐漸減少，這說(shuō)明酚酸類成分自尿液中排泄比較迅速[18]，在腎臟內(nèi)不易蓄積。由此可知，羊耳菊中酚酸類、黃酮類成分在大鼠體內(nèi)的主要分布器官具有一定相似性，同時(shí)又存在差異，一定程度上體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，為進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用提高依據(jù)。然而，本實(shí)驗(yàn)最后一個(gè)取樣點(diǎn)時(shí)，新綠原酸在心臟組織、3，4- 二咖啡?；鼘幩嵩谛呐K和肺組織、4，5- 二咖啡?；鼘幩嵩诜谓M織、木犀草苷在肺和腎組織分別達(dá)到了5 h內(nèi)的濃度峰值，因此無(wú)法預(yù)測(cè)其后續(xù)變化趨勢(shì)。下一步實(shí)驗(yàn)將針對(duì)這四種成分，延長(zhǎng)取樣時(shí)間點(diǎn)，測(cè)定其在相應(yīng)組織中的濃度，以期明確該成分在組織中的后續(xù)變化，為羊耳菊的臨床合理使用提供參考。