王 姝 韓正學

臨床上我們經(jīng)常見到因腫瘤切除及外傷造成的大面積組織缺損需要游離皮瓣修復的患者，游離皮瓣可以很好地恢復患者的容貌及功能。血管化的游離皮瓣移植術后皮瓣組織血運障礙、水腫及壞死等并發(fā)癥時常發(fā)生，其主要原因是缺血再灌注損傷。缺血再灌注損傷(Ischemia reperfusion Injury,IRI)指在血流灌注不足到再灌注早期重新獲取氧供應的過程中，組織或器官的組織損傷和病理變化的總稱。研究證實缺血再灌注會導致組織產(chǎn)生大量的氧自由基和炎性因子等，使細胞發(fā)生凋亡或者壞死，進而造成組織損傷，引起功能障礙甚至喪失生理功能[1-3]。目前治療此類損傷的主要方法是以減少氧自由基和炎性因子的產(chǎn)生為出發(fā)點，但治療效果不明顯。因此，進一步探索新的治療方法對臨床工作具有重要意義。

細胞外囊泡是細胞分泌的雙層脂質膜結構的顆粒，最初被認為是細胞排出的多余物質。直到20世紀90 年代，學者們才意識到這些細胞外囊泡攜帶膽固醇等脂類物質，富含多種生物活性物質，參與細胞存活與凋亡、血管新生、血栓形成、炎癥免疫反應等生理和病理過程[4]。細胞外囊泡主要存在于血液、淋巴液、唾液、尿液、乳汁等各種體液[5]。幾乎所有的細胞都可自發(fā)產(chǎn)生或在一定刺激下釋放細胞外囊泡[6]。因此，了解細胞外囊泡對缺血再灌注損傷的保護作用機制十分重要。本文就細胞外囊泡對缺血再灌注損傷保護作用方面的研究進行綜述，以期為治療游離皮瓣移植術后血管危象提供新思路。

1.細胞外囊泡

細胞外囊泡是細胞分泌的雙層脂質膜結構的微小囊泡，實質上是一組納米級顆粒。細胞外囊泡可分為外泌體、微囊泡、凋亡小體[7]。外泌體分子直徑30～100nm，在細胞內部形成，分泌方式特殊[8]。微囊泡也稱脫落囊泡或Ectosomes，分子直徑100～1000nm，是直接通過出芽方式從母細胞膜表面脫落產(chǎn)生。凋亡小體分子直徑為500～4000nm，是細胞程序性死亡或凋亡晚期釋放的微粒。研究發(fā)現(xiàn)，胚胎干細胞、骨髓間充質干細胞等多種細胞可以分泌細胞外囊泡，而細胞外囊泡在干細胞發(fā)揮促修復功能中起到重要作用[9,10]。細胞外囊泡中的外泌體和微囊泡在缺血再灌注損傷治療中的保護作用被大量研究證實。

2.MSCs 來源細胞外囊泡在缺血再灌注損傷治療中的作用

2.1 MSCs 來源細胞外囊泡對心臟損傷的保護作用 間充質干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是成體干細胞的一種,由于其自我更新、多向分化、靶向遷移、免疫調控、抗瘢痕以及抗凋亡等諸多重要的生理功能，使其在組織修復和再生方面被寄予厚望[11]。骨髓間充質干細胞經(jīng)低氧或低營養(yǎng)誘導后會分泌釋放細胞外囊泡[12]。Yoshihiro 和他的團隊[13]研究發(fā)現(xiàn)MSC 分泌的外泌體通過增強肌肉發(fā)生和血管生成促進肌肉再生，由miR-494等miRNAs 介導。有研究報道人來源骨髓間充質干細胞可能分泌外泌體，作用于缺血心肌后能夠改善心室的收縮及舒張功能，其對缺血再灌注心肌的保護作用可能通過減少氧化應激以及抑制TGF-β 信號傳導來實現(xiàn)[14]。Jose M 等[15]研究發(fā)現(xiàn)在所有測試的心臟缺血再灌注模型中，富含外泌體的部分具有強大的心臟保護作用，HSP70/TLR4 通路是外泌體介導心臟保護作用的關鍵。研究發(fā)現(xiàn)MSCs來源的外泌體可減少心肌纖維化，并且促進細胞增殖及血管新生，從而提升心肌干細胞的生存能力，改善心肌梗死后的心功能；該研究提出該保護機制可能和miRNA 相關，但具體機制尚不明確。有學者發(fā)現(xiàn)缺血再灌注發(fā)生時，具有保護作用的Nanog 蛋白和缺氧誘導因子1α 水平升高，進而上調miR-21 和miR-210，減少心肌細胞凋亡[16]。而誘導多能干細胞分泌的外泌體可保護細胞免受氧化應激損傷；進一步研究顯示，誘導多能干細胞來源的外泌體中包含miR-21 和miR-210，因此推測其保護作用可能是由miR-21 和miR-210 產(chǎn)生[10]。

2.2 MSCs 來源細胞外囊泡對腦損傷的保護作用 Daan R 等研究間充質干細胞分泌的細胞外囊泡(MSC-EV)在早產(chǎn)兒缺氧缺血性腦損傷的臨床前模型中的保護作用。他們通過閉塞臍帶使胎兒受到短暫的全面缺氧缺血后在子宮內靜脈注射MSC-EVs治療，采用大腦電生理參數(shù)分析評估MSC-EV 的治療效果。發(fā)現(xiàn)間充質干細胞分泌的細胞外囊泡通過減少總發(fā)作次數(shù)和持續(xù)時間，以及保持壓力感受器反射敏感性來改善腦功能。與此同時防止髓鞘降解的傾向[17]。已有大量研究發(fā)現(xiàn)MSCs 等來源的外泌體對神經(jīng)損傷有保護作用。缺血再灌注腦組織損傷主要通過氧化應激和炎性因子等造成，外泌體中含有抑制活性氧和炎癥的物質，而且可以透過血腦屏障，可能能作為治療腦損傷的一種新途徑[18]。除了神經(jīng)元細胞，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的其他細胞也分泌外泌體。Guitart 等[19]發(fā)現(xiàn)星型膠質細胞分泌的外泌體可以改善缺血條件下神經(jīng)元的存活能力，這種保護作用可能是通過減少氧化應激來實現(xiàn)的。Song等[20]研究發(fā)現(xiàn)M2 小膠質細胞來源的外泌體在體外和體內被神經(jīng)元所占用。M2 小膠質細胞來源的外泌體治療減弱了缺氧-葡萄糖剝奪后神經(jīng)元的凋亡。體內結果顯示，M2 小膠質細胞來源的外泌體治療可顯著減少短暫腦缺血3 天后的梗死體積和減輕行為缺陷。Xiao 等[21]研究證實內皮細胞來源的外泌體部分抑制了缺血再灌注損傷誘導的細胞周期阻滯和凋亡，抑制了SH-SY5Y 神經(jīng)細胞的增殖、遷移和侵襲。內皮細胞來源的外泌體直接保護神經(jīng)細胞免受缺血再灌注損傷。

2.3 MSCs 來源細胞外囊泡對腎臟損傷的保護作用 Federica 等[22]的動物實驗結果顯示下調人MSCs 中的miRNA 后MSCs 及其分泌的細胞外囊泡的再生能力在腎臟中降低。這種效應與細胞和細胞外囊泡的miRNA 組成發(fā)生變化有關。Zhang等[23]研究發(fā)現(xiàn)MSC 分泌的細胞外囊泡調節(jié)腎臟的氧化應激和炎癥反應。NADPH 氧化酶(NOX)-2在缺氧再灌注損傷的大鼠腎臟中表達上調，但在靜脈給予MSC 分泌的細胞外囊泡的缺氧再灌注損傷的大鼠腎臟中表達未上調。這種干預不僅減輕氧化應激，而且還減少細胞凋亡和增強腎細胞增殖，表明腎受體細胞中的NOX2 的轉錄后調節(jié)可能涉及MSC 分泌的細胞外囊泡誘導的腎修復。Zhou 等[24]研究順鉑誘導的急性腎損傷大鼠發(fā)現(xiàn)人臍帶間充質干細分泌的細胞外囊泡減弱了腎小管細胞的氧化應激、凋亡、壞死，減輕了腎功能障礙。腎修復效力的恢復主要依賴于富含間充質干細分泌的細胞外囊泡中的蛋白質。Faisal 研究證實MSCs 來源的外泌體對腎缺血再灌注損傷具有保護作用[25]。此外，ZOU 等[26]發(fā)現(xiàn)來源于人間充質干細胞的微囊泡通過抑制CX3CL1 改善大鼠腎臟缺血再灌注損傷。

3.MSCs 來源細胞外囊泡在游離皮瓣缺血再灌注損傷治療中的保護作用

近年,隨著顯微外科的發(fā)展，血管吻合技術應用于游離皮瓣移植術，游離皮瓣在修復重建領域的作用越來越重要。血運障礙即血管危象是游離皮瓣移植術后最常見的并發(fā)癥。延遲發(fā)現(xiàn)血管危象或出現(xiàn)更嚴重的血管危象，可導致游離移植組織瓣完全壞死，組織修復失敗。研究發(fā)現(xiàn)皮瓣在移植過程中處于缺血狀態(tài)，進而氧自由基釋放，導致微血管內皮細胞損傷。受傷的內皮細胞進一步釋放多種細胞因子，發(fā)生急性炎癥反應，誘發(fā)血小板凝集。炎癥反應加重，毛細血管床堵塞，持續(xù)缺氧和能量化合物耗竭使內皮細胞腫脹，血管腔閉塞。血液淤積，內皮細胞的纖溶活性喪失，因而凝血鏈被激活，皮瓣的微循環(huán)完全栓塞。

Bai 等[27]為了評估脂肪間充質干細胞(ADSC)的外泌體是否能在缺血再灌注損傷時保護皮瓣并誘導新生血管。通過結扎鼠左上腹下淺血管后再灌注血液，將來自正常的ADSC 外泌體和來自H2O2預處理的ADSC 外泌體注射到皮瓣中，觀察外泌體在皮瓣移植體內缺血再灌注損傷中的作用。與缺血再灌注相比，外泌體在體內顯著提高了皮瓣術后第5 天的存活率和毛細血管密度，降低了皮瓣的炎癥反應和細胞凋亡。此外，與正常外泌體相比，H2O2預處理的ADSC 外泌體的療效更好。來自低氧處理的人ADSCs 的外泌體具有增強脂肪移植血管生成的能力，部分是通過調節(jié)VEGF/VEGF-r 信號實現(xiàn)的[28]。

4.小結

囊泡分泌是細胞的基本生命過程，這些囊泡包裹了小RNA、質粒DNA、酶和神經(jīng)遞質等。MSCs來源的外泌體和微囊泡在缺血再灌注損傷治療中的保護作用被學者關注。研究缺血再灌注損傷的機制，可以為治療游離皮瓣移植術后血管危象提供新思路。隨著近年來研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)細胞外囊泡還在纖維化、自噬、免疫抑制及免疫激活等多方面發(fā)揮作用[29-31]。細胞外囊泡雖存在廣泛，但獲取細胞外囊泡的量少、純度低，目前研究對細胞外囊泡發(fā)揮作用的具體成分及其分子機制尚不清楚，仍需要投入更多的時間和精力深入研究。