翁雨天 黃 茜 楊旭娟 劉國光 劉一丹△

1)昆明醫(yī)科大學，云南 昆明 650500 2)昆藥集團股份有限公司，云南 昆明 650100

腦卒中是由于腦部血管突然破裂或因血管阻塞導致血液不能流入大腦而引起腦組織損傷的一組疾病。腦卒中是我國成年人致死致殘的首位病因，也是我國疾病致壽命損失的首位病因。目前最有效的治療手段是溶栓，但溶栓后腦組織在缺血情況下恢復供血，加重損傷腦組織，病情進一步惡化，這種病理現(xiàn)象被稱為腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)。CIRI的病理機制比較廣泛，主要包括氧化應激、炎性因子、NO大量合成、MMP-9表達上調、神經(jīng)細胞凋亡等[1]。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)主要介導生理病理刺激，如細胞因子、神經(jīng)遞質、激素、缺糖、缺氧等進而作出不同反應[2]。絲裂原活化的蛋白激酶級聯(lián)反應由至少三種激酶組成：MAPK激酶激酶(MAPKKK)、MAPK激酶(MAPKK或MKK)和MAPK。這些酶在所有真核生物中都是高度保守的，在各種發(fā)育和生理過程中都起著至關重要的作用。MAPK可分為4個亞族：ERK、p38、JNK和ERK5[3]。p38MAPK通路是MAPK通路的重要組成部分，調節(jié)細胞核相關基因的轉錄，介導了細胞炎癥、侵襲、凋亡、分化等重要的生理過程。GONG等[4]研究發(fā)現(xiàn)p38MAPK通路介導炎癥、氧化應激、細胞凋亡在CIRI整個病理進程中發(fā)揮著重要的作用。為了進一步深入了解p38MAPK通路與CIRI病理機制的關系，本文對p38MAPK通路在CIRI中的作用進行綜述，旨在為預防及治療CIRI提供一定的理論基礎。

1 p38MAPK的結構與生物學特性

p38是由360個氨基酸殘基組成的相對分子質量為38 000的鈣結合蛋白。p38通路由MAPKKK、MAPKK、MAPK組成，MAPKKK包括MEKK1至4(MEKK1-4)，MLK2和MLK3，DLK，ASK1和Tak1；MAPKK包括MEK3和MEK6；MAPK包括p38α、p38β、p38γ和p38δ同工型。其在氨基酸水平上具有高度的序列同源性(同工型之間>60%的同一性)。p38αMAPK在許多細胞類型中普遍表達，相反p38βMAPK在腦和肺中表達較高，p38γMAPK主要富集在骨骼肌和神經(jīng)系統(tǒng)，而p38δMAPK在子宮和胰腺中高表達[5]。所有同工型均具有相同的保守結構域(從Ⅰ到Ⅹ)和Thr-Gly-Tyr(TGY)雙磷酸化基序，通過TGY基序的靶向磷酸化被上游激酶(MAPKK)激活[6]。磷酸化的TGY基序和激活環(huán)的長度被確定為不同于其他兩個MAPK分支的成員，即細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)和c-jun N末端激酶(JNK)。這種獨特的特征可能賦予每個MAPK亞家族底物特異性[7]。

磷酸化的p38MAPK在胞質中，激活蛋白激酶，調節(jié)生理活動；進入核內，通過磷酸化轉錄因子，調控基因的表達。當細胞受到刺激后，通過高度保守且較復雜的三級激酶“級聯(lián)”程序轉導信號[8]，逐級磷酸化，調控基因的轉錄和表達，參與了細胞增殖、分化、應激和凋亡等多種細胞反應[9]。

2 p38MAPK在腦缺血再灌注損傷中的作用

2.1改善氧化應激損氧化應激損傷是腦缺血再灌注損傷的重要生理病理機制之一。環(huán)氧化酶-2 (cyclooxyge-nase2，COX-2)是催化花生四烯酸(arachidonic acid，AA) 生成前列腺素(prostaglandin，PG) 的限速酶。腦缺血再灌注時腦組織AA在COX-2催化作用下生成大量氧自由基。氧自由基可以引起DNA損傷及形成脂質過氧化物等機制而產(chǎn)生細胞毒性[10]。超氧離子與一氧化氮形成氧化能力更強的過氧亞硝基，引起腦組織損傷。p38MAPK通路在氧化應激反應過程中扮演著重要角色。PIAO等[11]在大鼠的腦缺血再灌注實驗中發(fā)現(xiàn)，缺血性半球中的COX-2的表達增加，使用了p38MAPK通路抑制劑SB203580后，COX-2 mRNA的表達明顯下降，說明通過p38MAPK通路可以調節(jié)COX-2的表達。NAVARRETE等[12]實驗發(fā)現(xiàn)NADA可明顯誘導腦血管細胞中COX-2 mRNA表達的上調和磷酸化p38MAPK，而p38MAPK通路抑制劑SB203580能夠阻止COX-2蛋白的上調，實驗表明NADA激活p38MAPK通路來調節(jié)COX-2 mRNA的表達從而誘導了輕度的腦血管細胞氧化應激。HOU等[13]在抗氧化劑CA研究中發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注增加了COX-2的表達，而CA抑制低氧刺激脂質過氧化，抑制了缺氧激活的COX-2信號通路，增加超氧化物歧化酶(SOD)的活性，降低了PGE2的產(chǎn)生。在實驗中發(fā)現(xiàn)CA劑量依賴性地降低COX-2的表達，而磷酸化p38MAPK表達也在下降。CA的保護作用可能是通過抑制p38MAPK通路的激活從而降低COX-2的表達保護細胞。

一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)分為3種類型：內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)以及誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)?；罨膃NOS和nNOS僅產(chǎn)生少量NO，而iNOS的活化受多種因素調控。SATO等[14]研究發(fā)現(xiàn)iNOS活化后可誘導產(chǎn)生大約1 000倍的eNOS和nNOS生成NO量的總和。過量的NO具有毒性作用，與超氧離子形成氧化能力更強的過氧亞硝基，引起腦組織損傷。CHENG等[15]發(fā)現(xiàn)在腦缺血再灌注后，缺血皮層中nNOS、iNOS、NO和磷酸化-p38 MAP激酶水平均顯著增加，使用Ferulic acid可以抑制NO、nNOS、iNOS、磷酸化-p38 MAP激酶的水平的升高。在實驗中發(fā)現(xiàn)抑制p38 MAP激酶介導的NO途徑可以保護神經(jīng)細胞的凋亡。Ferulic acid可能通過抑制p38MAPK磷酸化抑制NO的大量生成從而保護神經(jīng)細胞。CHEN等[16]在厚樸酚研究中發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷會誘導氧化應激，從而導致產(chǎn)生一氧化氮(NO)，蛋白質亞硝化的介體，以及其他活性氧(ROS)，改變了細胞氧化還原依賴性反應，并影響了蛋白質的錯誤折疊。厚樸酚通過p38MAPK失活而發(fā)生的途徑和降低CHOP的蛋白質水平，從而減少iNOS的誘導和產(chǎn)物的產(chǎn)生來抑制缺血再灌注引起的大鼠神經(jīng)元損傷。多種模型研究發(fā)現(xiàn)，p38MAPK通路在減輕細胞、組織、器官的氧化應激中發(fā)揮著重要作用。

2.2減輕炎性機制損傷炎性機制損傷是腦缺血再灌注損傷的重要生理病理機制之一。炎癥反應涉及到許多炎癥細胞和炎性介質，例如白細胞、膠質細胞、白細胞介素-1(interleukin，IL-1)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等[17]。腦缺血再灌注后炎性細胞因子的過度表達和炎性細胞浸潤，加重腦組織損傷[18]。白細胞介導腦缺血再灌注損傷的機制：阻塞微小血管，造成血管栓塞，釋放炎癥因子，增加血管通透性引發(fā)腦水腫，出血等[19]。小膠質細胞在CIRI中具有雙重作用：一方面吞噬壞死細胞碎片，分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，調節(jié)神經(jīng)組織的再生和重建；一方面分泌大量的炎癥因子和炎癥介質，引起神經(jīng)元損傷和血腦屏障破壞[20]。星形膠質細胞能誘導小膠質細胞分化、增殖，增強小膠質細胞和巨噬細胞的吞噬能力；誘導產(chǎn)生大量炎癥介質，造成腦組織損傷[21]。JIANG等[22]發(fā)現(xiàn)Bilobalide對腦神經(jīng)元的有保護作用。OGD/R大鼠腦缺血再灌注中p38MAPK蛋白的磷酸化顯著增加。Bilobalide抑制p38MAPK活化，降低了炎癥介質的產(chǎn)生。在實驗中發(fā)現(xiàn)磷酸化的p38MAPK可以磷酸化調節(jié)Hsp-27的MAP激酶AP-2和MAP激酶AP-3，增加促炎細胞因子TNF-α和IL-6的表達，誘導炎性級聯(lián)反應，并增加神經(jīng)元細胞損傷。Bilobalide通過抑制p38MAPK磷酸化來抑制炎癥介質的產(chǎn)生從而減少神經(jīng)元細胞的死亡。SONG等[23]研究發(fā)現(xiàn)MCAO后觀察到皮層中p38MAPK激活，繼而激活諸如TNF-α和IL-1b的細胞因子，從而增加血腦屏障的通透性。研究[24]發(fā)現(xiàn)MAPKs信號通路調節(jié)腦缺血再灌注損傷中炎癥基因的轉錄。p38MAPK被認為是應激誘導的激酶，這些激酶與細胞因子釋放和凋亡的調節(jié)有關。腦缺血再灌注損傷增加了p65的磷酸化，并促進了其內源性抑制劑IκBα的降解。與腦中IL-1β、IL-6和TNF-α水平的下調相一致，在NOD2缺陷小鼠中MAPKs的激活被顯著抑制。越來越多的證據(jù)表明，抑制MAPKs有助于抑制神經(jīng)炎癥，p38MAPK已被鑒定為神經(jīng)炎癥信號通路中的特異性標記[25]。p38MAPK的抑制，在腦缺血再灌注損傷后中導致炎性細胞的減少，從而減少炎癥介質的釋放。研究發(fā)現(xiàn)WT小鼠腦CIRI損傷后MAPKs被激活，而NOD2缺乏顯著抑制p38MAPK的激活[26]。p38MAPK通路在CIRI炎癥免疫應答中發(fā)揮著重要作用，為CIRI臨床預防和治療提供了一種新的方向。

2.3調控MMP-9蛋白表達基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)是一組Ca2+、Zn2+依賴性蛋白酶。MMPs家族已分離鑒別出二十余種，根據(jù)結構與底物的特異性，MMPs大致分為6類。MMP-9屬于明膠酶，主要功能是降解和重塑造細胞外基質(ECM)[27]。在正常生理條件下，參與血管新生、胚胎形成、創(chuàng)傷愈合；在病理狀態(tài)下，活化的MMP-9可以通過激活纖溶酶原作用于基底膜 (ECM) 成分，通過降解腦血管周圍基膜主要成分Ⅳ型明膠原、層粘連蛋白和纖粘連蛋白，導致腦微血管結構完整性破壞和血腦屏障破壞[28]。QIN等[29]研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷后MMP-9表達增加，salvianolic acid B (SalB) 給藥組的腦組織MMP-9表達明顯減少。NO通過鳥苷酸環(huán)化酶以及cGMP水平對MMP-9活性起到重要調節(jié)作用。salvianolic acid B能明顯抑制誘導型一氧化氮合酶NOS2的表達，從而減少MMP-9的表達。在多種細胞和刺激條件下，p38蛋白是NOS2表達所必需的調節(jié)因子。腦缺血再灌注損傷以后，腦組織p-p38含量明顯增加，salvianolic acid B可以明顯抑制p-p38的表達。salvianolic acid B可能通過p38MAPK通路抑制MMP-9的表達。DONG等[30]研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷中pentoxifylline顯著降低了MMP-9蛋白和p-p38蛋白的表達。pentoxifylline通過抑制NOS的表達水平，從而降低MMP-9蛋白的表達。p38MAPK途徑的可以調節(jié)一氧化氮的表達水平。pentoxifylline可能通過抑制p38MAPK的表達從而降低MMP-9的表達來保護神經(jīng)血管單元。TGF-β是一種多能細胞因子，參與許多神經(jīng)血管單元的生理和病理學過程。TAKAHASHI等[31]研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1處理腦細胞后，培養(yǎng)基中MMP-2和MMP-9呈濃度依賴方式顯著增加；而使用p38 MAP激酶抑制劑SB203580抑制了TGF-β1對MMP-9上調的作用；使用TGF-β受體抑制劑SB431542阻斷了TGF-β1誘導的p38 MAP激酶的磷酸化，表明轉化生長因子-β1(TGF-β1)可能通過p38絲裂原活化蛋白(MAP)激酶信號傳導誘導腦細胞中的MMP-9上調。動物模型中發(fā)現(xiàn)MMP-9與CIRI病理機制密切相關，p39MAPK通路與MMP-9蛋白還有待進一步研究。

2.4減少細胞凋亡細胞凋亡是指在生理病理的刺激下，基因調控細胞有序的死亡。以往認為凋亡是機體對環(huán)境條件的變化或緩和性損傷產(chǎn)生的應答有序變化的死亡過程，但不正常的細胞凋亡則是一種病理現(xiàn)象。CIRI神經(jīng)元凋亡機制有以下幾點：(1)生理病理因素刺激；(2)鈣超載[32]；(3)神經(jīng)元氧化損傷誘導凋亡的發(fā)生；(4)線粒體損傷[33]；(5)凋亡有關的細胞因子。SU等[34]于研究UCF-101治療的分子機制中發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌注損傷的大鼠模型中UCF-101具有減輕腦缺血再灌注損傷并減少凋亡神經(jīng)元的作用。UCF-101的特定抑制劑Omi/HtrA2顯著降低p-p38表達水平，顯著抑制caspase 3/9的活性表明UCF-101可能通過抑制p38MAPK的激活來抑制細胞凋亡，從而保護神經(jīng)細胞。JIE等[35]研究發(fā)現(xiàn)在中腦動脈阻塞(MCAO)小鼠模型中，TRPV4的蛋白質水平會隨著持續(xù)的再灌注而增加。注射TRPV4激動劑GSK的小鼠中p-p38MAPK的蛋白質水平顯著增加，Bcl-2/Bax蛋白比率的顯著增加。注射p38MAPK拮抗劑顯著減弱了注射GSK的小鼠中Bcl-2/Bax蛋白比率的降低和casapse-3蛋白裂解的水平的升高。實驗表明TRPV4的過度激活增強p38MAPK信號通路，使Bcl-2/Bax蛋白比值負向移動并最終激活caspase-3，最終誘導細胞凋亡。p38MAPK通路在細胞凋亡方面發(fā)揮著重要作用，降低細胞凋亡，保護神經(jīng)細胞，為臨床預防治療提供一種新的策略[36]。

本文基于目前研究現(xiàn)狀對p38MAPK在CIRI中的關系進行了綜述，但對目前p38MAPK與CIRI中的具體聯(lián)系還未完全闡明。p38MAPK是MAPK 家族中重要的成員，其在細胞凋亡、侵襲、炎癥、缺血再灌注損傷等方面均發(fā)揮重要作用。腦缺血再灌注損傷機制的研究對于血腦屏障的保護有重要臨床意義，亦是近年來的研究熱點，目前在這方面的成果寥寥無幾，能夠對臨床具有指導意義的更是甚少。p38MAPK在腦缺血再灌注的發(fā)生以及過程均發(fā)揮了重要作用，對p38MAPK在腦缺血再灌注作用及機制的不斷研究，可能為腦缺血再灌注的臨床防治提供一個新的方向。