林特，夏志軍

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004）

盆腔器官脫垂（pelvic organ prolapse，POP）是由各種原因引起的盆底支持組織出現(xiàn)薄弱而導(dǎo)致器官位置及功能異常，是影響全球近50%的50歲以上女性的健康問題［1］。POP的確切發(fā)病機制目前尚不明確，但其發(fā)生與經(jīng)陰道分娩次數(shù)、年齡、慢性腹壓增高、職業(yè)及合并疾病等因素有關(guān)。研究［2］表明，POP患病率及風險隨年齡增加而增高。但也有研究［3］顯示，年齡并不能作為POP的獨立危險因素。p16是衰老相關(guān)的有效生物標志物［4］。前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）能促進相關(guān)組織分泌炎性細胞因子誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生，但也有助于急性炎癥消退與后續(xù)組織修復(fù)［5］。同時，PGE2是環(huán)氧化酶2（cyclooxygenase 2，COX2）/PGE2信號通路的產(chǎn)物，與肌腱、骨、軟骨等組織代謝相關(guān)［6］。因此，本研究擬觀察POP患者子宮骶韌帶組織中COX2、PGE2、p16、Ⅰ型膠原蛋白（collagenⅠ，COLⅠ）和Ⅲ型膠原蛋白（collagen Ⅲ，COLⅢ）的表達變化及其與年齡的相關(guān)性，探討組織衰老、損傷與子宮骶韌帶纖維組織變化及POP發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象：選擇2016年1月至2018年3月于我院行子宮全切術(shù)的患者（已獲得本院倫理委員會批準，患者已知情同意）共81例。根據(jù)是否患有POP，將全部患者分為POP組與對照組。POP診斷標準參照國際尿控協(xié)會公布的POP定量分期法（POP-Q），所有POP患者分期均為Ⅲ～Ⅳ度。對照組均為因良性疾病行子宮全切術(shù)，且近3個月未服用激素類藥物，無雌激素相關(guān)疾病，無盆腔炎、婦科惡性腫瘤、結(jié)締組織疾病等。根據(jù)年齡再將2組患者分別分為＜55歲與＞65歲2個亞組，即＜55歲POP組（20例），＞65歲POP組（20例），＜55歲對照組（21例），＞65歲對照組（20例）。2組的一般資料具有可比性，見表1。

1.1.2 主要試劑：COX2抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；PGE2抗體、COLⅠ抗體［艾博抗Abcam（上海）貿(mào)易有限公司］；p16INK4A抗體、COLⅢ抗體（美國Proteintech Group有限公司）；兔SP試劑盒（兔鏈霉卵白素-生物素法檢測系統(tǒng)，中國上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；DAB顯色試劑盒（中國北京索萊寶科技有限公司）。

表1 POP組和對照組患者一般資料比較Tab.1 Comparison of baseline characteristics of control and POP groups

1.2 方法

從手術(shù)切除的組織中取接近宮頸的子宮骶韌帶組織，大小約1 cm×1 cm×1 cm，經(jīng)固定脫水、包埋，制成石蠟標本，4 μm厚連續(xù)切片。常規(guī)脫蠟、抗原修復(fù)，按SP免疫組化試劑盒說明書操作，檢測各組組織中COX2、PGE2、p16、COLⅠ、COLⅢ的表達情況，DAB顯色，蘇木素復(fù)染返藍，脫水透明，中性樹膠封片。

采用雙盲評分法對免疫組化結(jié)果進行判定，并由2位觀察者閱片。在400倍視野下隨機選取5個視野，陽性表達呈棕黃色顆粒狀或片狀，按陽性細胞著色強度進行評分，無著色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕黃色以及棕褐色為3分。每張切片在400倍光學(xué)顯微鏡下取3個高倍視野觀察，按陽性細胞數(shù)所占百分比評分，評分后取均值，陰性為0分，陽性細胞百分比≤10%為1分，＞10%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分。取2項評分的乘積作為總分，≤2分為陰性（-），3～4分為弱陽性（+），5～8為中等陽性（++），9～12分為強陽性（+++）。-/+為低表達，++/+++為高表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行χ2檢驗和Spearman相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮骶韌帶組織中PGE2的表達

免疫組化結(jié)果顯示，PGE2表達于細胞質(zhì)，見圖1。POP組PGE2表達水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），但＜55歲和＞65歲亞組并無明顯差異，見表2。

圖1 子宮骶韌帶組織中PGE2和COX2的表達 SP ×400Fig.1 PGE2 and COX2 expression in uterosacral ligaments of each group SP ×400

表2 POP組與對照組子宮骶韌帶組織中PGE2的表達情況Tab.2 Expressions of PGE2 in the uterosacral ligaments of control and POP groups

2.2 子宮骶韌帶組織中COX2的表達

免疫組化結(jié)果顯示，COX2表達于細胞質(zhì)，見圖1。POP組COX2表達水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），但＜55歲和＞65歲亞組并無統(tǒng)計學(xué)差異，見表3。

表3 POP組與對照組子宮骶韌帶組織中COX2的表達情況Tab.3 Expressions of COX2 in the uterosacral ligaments of control and POP groups

2.3 子宮骶韌帶組織中p16的表達

p16蛋白表達于組織細胞核和細胞質(zhì)中，見圖2。POP組與對照組p16蛋白表達水平無統(tǒng)計學(xué)差異，但＞65歲亞組表達水平較＜55歲亞組增高，見表4。

2.4 子宮骶韌帶組織中COLⅠ和COLⅢ的表達

COLⅠ和COLⅢ表達于細胞質(zhì)中，見圖3。POP組二者表達水平均低于對照組，見表5。

2.5 相關(guān)性分析

圖2 各組患者子宮骶韌帶組織中p16的表達SP×400Fig.2 p16 expression in uterosacral ligaments from each group SP×400

表4 POP組與對照組子宮骶韌帶組織中p16的表達情況Tab.4 Expressions of p16 in the uterosacral ligaments of control and POP groups

Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，COX2與PGE2的表達呈正相關(guān)，與COLⅠ、COLⅢ的表達呈負相關(guān)，見表6。

3 討論

POP是一種多因素疾病，嚴重影響女性的生活質(zhì)量。目前的研究認為POP的發(fā)生與盆底組織結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維對器官有支撐作用，而這種支撐需要細胞外基質(zhì)各成分含量和比例的平衡，無論何種原因引起的失衡均會降低組織的機械強度，使POP易于發(fā)生。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，COLⅠ和COLⅢ的表達在POP組子宮骶韌帶中顯著減少，提示膠原纖維含量的減少可能與POP發(fā)生相關(guān)。有研究證實，盆底功能障礙患者盆底支持組織中膠原蛋白含量減少并不是因為合成減少，而是由于膠原蛋白降解增多，這與基質(zhì)金屬蛋白酶家族（matrix metalloproteinase，MMPs）、金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMPs）及兩者的比例相關(guān)。轉(zhuǎn)換生長因子-β（transforming growth factor beta，TGF-β）對MMPs和TIMPs的調(diào)節(jié)作用在膠原代謝中起重要作用［7-8］。盆底組織在承受牽拉、擠壓等外力作用時，逐漸釋放炎性細胞因子，導(dǎo)致膠原代謝紊亂，韌帶組織松弛。

圖3 子宮骶韌帶組織中COLⅠ、COLⅢ的表達 SP×400Fig.3 COLⅠ and COLⅢ expression in uterosacral ligaments of each group SP×400

表5 POP組與對照組子宮骶韌帶組織中COLⅠ和COLⅢ的表達情況Tab.5 Expressions of COLⅠ和COLⅢ in the uterosacral ligaments of control and POP groups

表6 PGE2和COX2、COLⅠ、COLⅢ表達的相關(guān)性Tab.6 Correlation between expression of PGE2 and COX2，COLⅠ，COLⅢ

COX2/PGE2信號通路對應(yīng)力刺激敏感，在病理性瘢痕組織中，COX2蛋白表達高于正常組織，其代謝產(chǎn)物會增加炎癥反應(yīng)，影響成纖維細胞的遷移［9］。也有研究［10-11］證實，在皮膚、血管壁、牙周等組織中，PGE2可拮抗膠原纖維的形成。在樹突細胞中，PGE2可誘導(dǎo)MMP9的表達［12］，PGE2低表達可使MMP/TIMP比值下降，在血管壁重塑和膠原纖維形成中起重要作用［13］；PGE2還能在肝星形細胞、乳腺上皮細胞和肺成纖維細胞中拮抗TGF-β信號通路［14］。本研究結(jié)果表明，COX2/PGE2在POP患者子宮骶韌帶組織中的表達高于對照組，說明POP患者子宮骶韌帶組織炎性細胞因子表達增多，且COX2/PGE2表達與年齡無關(guān)。同時，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)PGE2和COX2的表達呈正相關(guān)，與COLⅠ和COLⅢ的表達呈負相關(guān)，說明COX2表達增加可使PGE2表達增加，而PGE2卻可使膠原纖維蛋白表達減少，提示COX2/PGE2信號通路在膠原代謝中起重要作用。

＞65歲的POP組與對照組p16的表達均高于＜55歲組，提示其可能作為組織衰老的指標。而p16在POP組與對照組中的表達無統(tǒng)計學(xué)差異，提示這2組組織衰老程度無顯著差異。年齡增加導(dǎo)致的組織衰老并不能完全解釋POP的發(fā)生，在2組患者組織衰老程度無明顯差異的情況下，POP組患者細胞外基質(zhì)中與炎癥相關(guān)的因子COX2/PGE2的含量與組織中COLⅠ、COLⅢ的含量存在相關(guān)性，即COX2/PGE2表達增加可使組織中膠原纖維含量減少，組織成分改變，正常組織呈現(xiàn)病理狀態(tài)，與POP發(fā)生發(fā)展相關(guān)。COX2/PGE2表達增加可能與既往組織損傷相關(guān)，也可能與個體自身調(diào)節(jié)能力相關(guān)，即與遺傳因素導(dǎo)致的個體差異相關(guān)。推測以上可能是臨床患者，尤其是中青年女性POP患者主要的發(fā)病機制。

綜上所述，本研究結(jié)果提示COX2/PGE2信號通路與子宮骶韌帶組織中膠原纖維代謝密切相關(guān)，而且老齡并不是POP發(fā)生的主要危險因素，組織中炎癥相關(guān)因子的變化使盆底支持組織呈現(xiàn)松弛狀態(tài)可能是POP發(fā)生的主要原因。