田啟遠, 王曉萌, 葉聰艷, 潘 晴, 曾小群*, 潘道東, 沈建良

發(fā)酵乳桿菌RC4對咸肉亞硝酸鹽含量及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

田啟遠1,2,3, 王曉萌1,2,3, 葉聰艷1,2,3, 潘 晴1,2,3, 曾小群1,2,3*, 潘道東1,2,3, 沈建良4

（1.農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險防控國家重點實驗室, 浙江 寧波 315832; 2.浙江省動物蛋白食品精深加工技術(shù)重點實驗室, 浙江 寧波 315832; 3.寧波大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院, 浙江 寧波 315832; 4.浙江卓旺農(nóng)業(yè)科技有限公司, 浙江 湖州 313014）

為降低咸肉中亞硝酸鹽含量, 將具有高效降解亞硝酸鹽的發(fā)酵乳桿菌RC4應(yīng)用于咸肉制作中, 研究其對咸肉亞硝酸鹽含量、品質(zhì)和風(fēng)味的影響. 通過單因素實驗及正交實驗, 對添加發(fā)酵乳桿菌RC4的實驗組咸肉制作工藝進行優(yōu)化, 比較接菌組和未接菌發(fā)酵對照組在感官評分、亞硝酸鹽含量、pH、色差、水分、硫代巴比妥值及揮發(fā)性風(fēng)味成分的差異. 結(jié)果表明: 實驗組咸肉亞硝酸鹽含量降解顯著, 降解率為78.60%; 實驗組咸肉的最佳發(fā)酵條件為接種2.0%(μL·mL-1)的發(fā)酵乳桿菌RC4菌液, 18℃發(fā)酵10d. 與對照組相比, 實驗組咸肉pH降低; 色差及水分含量與對照組差異不顯著(＞0.05); TBA值的變化量明顯小于對照組(＜0.05). 在鑒定出的87種揮發(fā)性物質(zhì)中, 庚醛為RC4發(fā)酵產(chǎn)生, 苯甲醛等的含量顯著高于對照組, 而這幾種醛均為特征風(fēng)味化合物. 由此可知, 在咸肉制備工藝中, 添加發(fā)酵乳桿菌RC4能顯著降低咸肉的亞硝酸鹽含量, 提高咸肉保質(zhì)期, 增加其特征風(fēng)味化合物含量.

發(fā)酵乳桿菌RC4; 咸肉; 亞硝酸鹽含量; 理化指標; 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

咸肉是我國傳統(tǒng)的腌臘肉制品, 歷史悠久, 風(fēng)味獨特, 營養(yǎng)豐富, 便于儲藏, 深受消費者青睞[1]. 在咸肉加工中, 常使用亞硝酸鹽作為添加劑, 其具有發(fā)色、保持風(fēng)味、抗氧化和抑制革蘭氏陽性菌生長等特性[2-5]. 但過量食用亞硝酸鹽含量超標的咸肉, 會引發(fā)高鐵血紅蛋白癥, 并且亞硝酸鹽能在體內(nèi)形成亞硝胺, 誘發(fā)機體癌變[6]. 生產(chǎn)中即使按照國家規(guī)定標準使用亞硝酸鹽, 也會造成肉類制品中亞硝酸鹽殘留量較高[7]. 因此, 亞硝酸鹽殘留量高已成為傳統(tǒng)腌臘肉制品生產(chǎn)的瓶頸問題, 嚴重制約了我國腌臘肉制品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展.

乳酸菌是一種常用的食品發(fā)酵添加菌, 安全有益, 其代謝產(chǎn)物可以使發(fā)酵食品產(chǎn)生良好的風(fēng)味和口感, 并降低pH, 抑制有害菌種的生長, 因此常常把它作為自然降解亞硝酸鹽的理想菌株[8]. 乳酸菌可產(chǎn)生亞硝酸鹽還原酶, 催化亞硝酸鹽還原, 進而降解亞硝酸鹽[9]. 本課題前期研究從新疆酸馬奶中篩選出一株具有高效降解亞硝酸鹽的發(fā)酵乳桿菌RC4, 其在含150mg·L-1亞硝酸鹽的培養(yǎng)基中, 19℃培養(yǎng)14h, 可降解82%的亞硝酸鹽[10]. 本實驗將發(fā)酵乳桿菌RC4應(yīng)用于咸肉發(fā)酵中, 研究其對亞硝酸鹽降解和咸肉儲存性及品質(zhì)風(fēng)味的影響, 為制備低亞硝酸鹽含量的腌臘肉制品提供技術(shù)支持和研究基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬肉: 購于寧波大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場; 發(fā)酵乳桿菌() RC4(CGMCC NO.8212): 本實驗室保存; NaNO2: 國藥集團化學(xué)試劑有限公司; 吐溫80: 北京索萊寶生物科技有限公司; MRS培養(yǎng)基: 杭州微生物試劑有限公司; TBA檢測試劑盒: 杭州江萊生物研究所; 亞硝酸鹽檢測試劑盒: 廣州益滿生物科技有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

磁力攪拌器HJ-4: 常州申光儀器有限公司; SPME手動進樣手柄、75μm CAR/PDMS萃取頭: 美國Supelco公司; 7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀: 美國Agilent公司; CR 400色差儀: 日本柯尼卡美能達; PL403電子天平: 梅特勒-多利托儀器有限公司; LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌鍋: 上海申安醫(yī)療器械廠; JB090312-02凈化工作臺: 蘇州華科凈化設(shè)備有限公司; H2050R-2離心機: 長沙湘儀離心機儀器有限公司; pH計: 梅特勒-托利多儀器上海有限公司.

1.3 方法

1.3.1 菌種擴大培養(yǎng)

取-80℃冰箱保存的發(fā)酵乳桿菌RC4活化, 以1％的接種量接種至MRS培養(yǎng)基中, 19℃培養(yǎng)12~ 14h, 2次擴大培養(yǎng)后, 離心收集菌體, 棄培養(yǎng)基, 加生理鹽水重懸菌液至原培養(yǎng)基的體積, 于波長600nm測量菌懸液吸光度OD值.

1.3.2 咸肉的腌制

將新鮮豬肉修整后切成為15cm×10cm×2 cm(長×寬×高)的方塊, 向原料肉中添加5%的食鹽和150mg·kg-1亞硝酸鈉[11], 在肉表面均勻擦透, 噴灑菌懸液發(fā)酵作為實驗組(對照組噴灑相同體積的生理鹽水), 腌制12h, 吊掛風(fēng)干1d.

1.3.3 咸肉的感官評定及亞硝酸鹽含量測定

培訓(xùn)10名食品專業(yè)學(xué)生, 組成感官評定小組, 對煮熟后的咸肉分實驗組和對照組進行品嘗, 按表1進行感官評分, 并測定亞硝酸鹽含量. 感官評定標準在GB 2730-2015[12]的基礎(chǔ)上略有改動.

1.3.4 咸肉發(fā)酵單因素實驗

按照1.3.2的方法制備咸肉, 在預(yù)實驗基礎(chǔ)上進行以下單因素實驗. (1)接菌量的優(yōu)化: 接種量分別為1.4%, 1.6%, 1.8%, 2.0%, 2.2%(μL·mL-1), 19℃發(fā)酵8d; (2)發(fā)酵溫度的優(yōu)化: 將1.8%(μL·mL-1)發(fā)酵乳桿菌RC4菌液噴灑于咸肉中, 于14, 16, 18, 20, 22℃下發(fā)酵8d; (3)發(fā)酵時間的優(yōu)化: 以1.8%的接種量, 19℃分別發(fā)酵7, 8, 9, 10, 11d. 各對照組咸肉噴灑與菌液相同體積的生理鹽水制備. 以此確定最適接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間.

1.3.5 正交實驗

由單因素實驗結(jié)果設(shè)計正交試驗, 分別測定咸肉的感官評分與亞硝酸鹽的含量.

1.3.6 咸肉的驗證實驗

由正交實驗得到的最佳發(fā)酵條件, 對咸肉亞硝酸鹽含量和感官評分進行驗證實驗.

1.3.7 咸肉色差的測定

隨機選取咸肉任一切面的3個點, 使用色差儀對咸肉的L、a、b值進行檢測. 其中,L為明度系數(shù), 變化范圍為0~100,L值等于0代表黑色,L值等于100代表白色, 在0~100之間為不同的亮度值; +a值代表紅色, -a值代表綠色; +b值代表黃色, -b值代表藍色.

1.3.8 pH值的測定

稱取10g剪碎后的咸肉樣品置于50mL離心管中, 加10mL蒸餾水, 勻漿1min, 測定pH值.

1.3.9 水分的測定

參照邢寶田等[13]方法, 稱取剪碎后的咸肉樣品10g, 置于水分分析儀, 測定咸肉的水分含量.

1.3.10 硫代巴比妥酸值的測定

參照Witte等[14]的方法, 將肉勻漿后過濾, 測定咸肉濾液的硫代巴比妥酸(TBA)值.

1.3.11 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

揮發(fā)性風(fēng)味成分的提取: 稱4.0g切碎的咸肉樣品, 放入20mL頂空樣品瓶內(nèi). 樣品瓶通過聚四氟乙烯/硅膠隔膜使其保持密封狀態(tài). 在45℃條件下, 平衡25min, 再用75μm CAR/PDMS的萃取頭4℃頂空吸附40min. 萃取頭在第1次使用前, 需在220℃下老化2h, 采用SPME-GC-MS對咸肉揮發(fā)性風(fēng)味進行分析.

表1 咸肉的感官評分標準

揮發(fā)性風(fēng)味成分的檢測及分析: 采用SPME- GC-MS分析咸肉的揮發(fā)性風(fēng)味化合物, GC-MS條件參照周昌瑜等[15]的方法.

揮發(fā)性物質(zhì)分析: 質(zhì)譜數(shù)據(jù)測量依據(jù)NIST和WILEY 7.0, 相似指數(shù)高于80(最大值為100)確認為鑒定化合物.

1.3.12 統(tǒng)計分析

上述實驗均重復(fù)3次, 每次3組平行, 運用IBM SPSS Statistics 21統(tǒng)計軟件進行單因素方差數(shù)據(jù)分析, 以Mean±SD表示, 使用Origin Graph對試驗結(jié)果分析作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 咸肉發(fā)酵單因素實驗結(jié)果

2.1.1 接種量()優(yōu)化結(jié)果

接種1.4%, 1.6%, 1.8%, 2.0%, 2.2%發(fā)酵乳桿菌RC4菌液的實驗組咸肉亞硝酸鹽降解率分別為65.5%, 72.3%, 71.53%, 85.0%, 71.2%; 而各對照組對應(yīng)時間的亞硝酸鹽降解率分別為-4.6%, -2.8%,-6.1%, 0.6%, 10%(圖1(a)), 差異極顯著(＜0.01). 其中, 接種量為2.0%(μL·mL-1)的咸肉亞硝酸鹽降解率最高.

2.1.2 發(fā)酵溫度()優(yōu)化結(jié)果

在14, 16, 18, 20, 22℃下發(fā)酵的實驗組咸肉, 其NaNO2的降解率分別為27.9%, 28.97%, 55.1%, 33.86%, 31.1%, 而對照組在對應(yīng)時間降解率分別為-1.01%, -10.7%, 10.57%, -3.89%, 4.0%(圖1(b)), 差異顯著(＜0.05). 可見發(fā)酵乳桿菌RC 4在18℃亞硝酸鹽降解率最高.

各對照組咸肉的亞硝酸鹽含量不減少反而增加, 原因可能是咸肉中的硝酸鹽在細菌作用下還原成亞硝酸鹽, 增加了其亞硝酸鹽含量, 因而降解率為負值[16].

2.1.3 發(fā)酵時間()優(yōu)化結(jié)果

實驗組咸肉在發(fā)酵7, 8, 9, 10, 11d的時間內(nèi), 亞硝酸鹽降解率分別為51.23%, 46.23%, 35.6%, 73.63%, 52.04%(圖1(c)), 而對照組咸肉在其相對應(yīng)時間的降解率分別為-7.8%, -9.6%, 1.0%, -7.8%, 0.63%. 由此表明, 加菌發(fā)酵的咸肉亞硝酸鹽降解率高于對照組(＜0.05), 發(fā)酵10d亞硝酸鹽降解率最高.

2.1.4 咸肉發(fā)酵工藝優(yōu)化的正交試驗結(jié)果

由表2和表3獲得最優(yōu)降解亞硝酸鹽實驗方案:222, 即發(fā)酵溫度18℃, 接種量為2.0%, 發(fā)酵時間10d. 得到影響亞硝酸鹽降解率和感官評分因子主次順序為:＞＞, 即接種量＞溫度＞時間.

表2 咸肉發(fā)酵工藝優(yōu)化L9(34)正交試驗結(jié)果

注:、為亞硝酸鹽對應(yīng)數(shù)值;’、’為感官評分對應(yīng)數(shù)值.

表3 咸肉亞硝酸鹽降解率方差分析結(jié)果

注: 1)表示顯著, 0.01<<0.05.

2.1.5 咸肉的驗證實驗

在正交實驗獲得最佳發(fā)酵條件下, 添加2.0%的發(fā)酵乳桿菌RC4, 18℃發(fā)酵10d, 亞硝酸鹽殘留量為3.22mg·kg-1, 遠低于國家規(guī)定20mg·kg-1的安全標準.

2.2 添加發(fā)酵乳桿菌RC4對咸肉各理化指標的影響

2.2.1 咸肉色差的測定結(jié)果

由圖2可見, 實驗組和對照組咸肉L值、b值均呈下降趨勢,a值呈上升趨勢. 其中發(fā)酵7~11d, 實驗組L值在發(fā)酵過程中一直高于對照組. 實驗組咸肉的a值一直低于對照組, 在16d左右時差值最大; 實驗組對照組的b值在20d期間產(chǎn)生一個交點, 此時b值相等.

2.2.2 添加發(fā)酵乳桿菌RC4咸肉pH測定結(jié)果

pH值是反映肉品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標之一[17]. 如圖3所示, 前7d咸肉pH迅速下降, 發(fā)酵7~9d, 對照組咸肉pH從6.90緩慢下降至6.86, 差異不顯著(＞0.05), 而實驗組咸肉的pH在發(fā)酵7~11d從6.90下降至6.45, 變化差異顯著(＜0.05), 這可能是發(fā)酵乳桿菌RC4進行乳酸發(fā)酵的結(jié)果, 符合乳酸菌發(fā)酵咸肉的產(chǎn)品特性.

2.2.3 咸肉水分含量的測定結(jié)果

如圖3所示, 實驗組和對照組咸肉水分含量均呈下降趨勢, 分別下降了28.01%和29.88%, 實驗組水分含量略低, 差異不顯著(＞0.05).

2.2.4 咸肉硫代巴比妥酸值的測定結(jié)果

從圖3可知, 除發(fā)酵18d左右實驗組的TBA值高于對照組外, 整個發(fā)酵過程中實驗組的TBA值都低于對照組TBA值, 并且只有12~18d時, 實驗組TBA值上升速度高于對照組, 其他時間實驗組的TBA值上升速度均顯著低于對照組(＜0.05), 原因可能是發(fā)酵乳桿菌抑制了咸肉脂肪的氧化, 有利于延長其保質(zhì)期[18].

2.2.5 咸肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測利用

咸肉中共檢測出87種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)(表4). 實驗組咸肉檢測出73種化合物, 其中醇類17種、醛類10種、酮類9種、酯類6種、酸類7種、醚類1種、烴類23種; 對照組咸肉檢測出67種化合物, 其中醇類13種、醛類8種、酮類8種、酯類10種、酸類7種、醚類1種、烴類20種. 實驗組樣品的醛、酮、烴類物質(zhì)含量較多, 對照組醇、酮、酯類物質(zhì)含量較多, 其中, 實驗組醇類化合物相對含量逐漸減少, 尤其是乙醇含量的降低最為顯著, 由10.04%降低為6.62%, 這與醇類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)或者氧化反應(yīng)有關(guān). 醇類具有比醛類更高的閾值, 它們對咸肉的風(fēng)味影響不大[19]. 醛類比醇類對風(fēng)味有更大的貢獻, 醛類物質(zhì)通常具有植物的青草芳香味以及肉制品特有的脂肪香味[20]. 與對照組相比, 實驗組咸肉中醛類物質(zhì)的總含量除丁二醛與(E)-2-己烯醛81略有減少, 2,4-戊二烯醛、苯甲醛、辛醛、壬醛等物質(zhì)均有顯著增加(＜0.05), 它們的閾值較低, 對發(fā)酵肉制品風(fēng)味貢獻較大. 值得關(guān)注的是, 實驗組檢測到了對照組不存在的庚醛, 而庚醛具有腌制味、烤肉香、油脂香、柑橘香等獨特的氣味[19]. 酮類化合物中, C4-C9酮類物質(zhì)是β-氧化產(chǎn)生的, 具有強烈的氣味并具有較低閾值[21], 實驗組咸肉中的3-羥基-2-丁酮為代表性的特征風(fēng)味化合物, 其含量反應(yīng)了酮類化合物總含量的變化趨勢, 表現(xiàn)為甜香及奶制品香. 丙酮等的物質(zhì)在發(fā)酵后未檢出, 這可能是由于氧化產(chǎn)生了酸類或者自然風(fēng)干發(fā)酵加速揮發(fā)導(dǎo)致[22]. 本試驗中檢測到的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與劉文營等[23]、Yu等[24]、Yang等[25]的檢測結(jié)果等基本一致, 在其種類和相對含量上有一定差異, 這可能是發(fā)酵咸肉的原材料及發(fā)酵成熟條件不同導(dǎo)致的[26].

注: “*”表示差異顯著; “-”表示未檢測出.

3 結(jié)論

咸肉中添加2%(μL·mL-1)具有高效降解亞硝酸鹽的發(fā)酵乳桿菌RC4, 18℃發(fā)酵10d, 獲得了感官評分高、亞硝酸鹽含量低的咸肉產(chǎn)品, 其pH、水分含量降低, 色澤更鮮紅、飽滿, TBA增加量減少, 表明發(fā)酵乳桿菌有效的降低了酸度、水分, 抑制了脂肪氧化, 從而有利于咸肉保質(zhì)期的提高. GC-MS分析鑒定出87種揮發(fā)性物質(zhì), 實驗組(73種)比對照組(67種)多6種揮發(fā)性物質(zhì), 其中醇類、醛類和烴類物質(zhì)種類數(shù)量明顯增多, 添加發(fā)酵乳桿菌RC4后新產(chǎn)生了庚醛, 這些醛類物質(zhì)極大的提高了咸肉風(fēng)味.

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Application ofRC4 on salted meat for nitrite degradation and quality improvement

TIAN Qiyuan1,2,3, WANG Xiaomeng1,2,3, YE Congyan1,2,3, PAN Qing1,2,3, ZENG Xiaoqun1,2,3*, PAN Daodong1,2,3, SHEN Jianliang4

( 1.State Key Laboratory for Managing Biotic and Chemical Threats to the Quality and Safety of Agro-products, Ningbo 315832, China; 2.Key Laboratory of Animal Protein Food Processing Technology of Zhejiang Province, Ningbo 315832, China; 3.College of Food and Pharmaceutical Sciences, Ningbo University, Ningbo 315832, China; 4.Zhejiang Zhuowang Agricultural Technology Co., Ltd., Huzhou 313014, China )

() RC4 with efficient nitrite degradation ability were applied to prepare salted meat and decrease its nitrite content. The effects ofRC4 on the nitrite content, quality and flavor of salted meat were examined. Single-factor experiments and orthogonal experiments were used to optimize the processing technology of experimental group salted meat by including. The sensory score, nitrite content, pH, color difference, moisture, thiobarbital (TBA) value and volatile flavor components were detected to compare the experimental and control group. The results showed that the optimal fermentation conditions for the experimental group salted meat were as follows: inoculating 2.0%(μL·mL-1)on salted meat and fermenting for 10d at 18℃. The nitrite content of the experimental group and that of the control group was 3.22 and 15.28 mg·kg-1respectively. The nitrite content of the experimental group was 21.07% of the control group, 78.60% lower than prior to fermentation. During fermentation of the experimental group, the pH decreased from 6.9 to 6.45. The color and the water content were not significantly different from the control group (>0.05). The TBA value increment was significantly lower than the control group (<0.05), which indicated that lipid oxidation was significantly inhibited by adding. A total of 87 kinds of volatile substances were identified. Aldehydes, alcohols, acids and ketones significantly affected the flavor of salted meat. Heptaldehyde produced byfermentation was not detected in the control group. Heptaldehyde, benzaldehyde, octanal and furfural obviously increased in the experimental group and these compounds are characteristic flavor compounds in the experimental group. Conclusion: By includingRC4 with nitrite degradation characters in processing salted meat can significantly reduce the nitrite content of salted meat and increase its quality and flavor.

RC4; bacon; nitrite content; physical and chemical indicators; volatile flavor substances

TS251.5

A

1001-5132（2020）01-0038-07

2019?04?30.

寧波大學(xué)學(xué)報（理工版）網(wǎng)址: http://journallg.nbu.edu.cn/

國家自然科學(xué)基金（41641052, 41406165）; 浙江省公益技術(shù)研究計劃（LGN19C200011）; 浙江省教育廳科研項目（Y201941438）.

田啟遠（1995－）, 男, 山東臨沂人, 在讀碩士研究生, 主要研究方向: 發(fā)酵食品加工. E-mail: 1115132131@qq.com

曾小群（1982－）, 女, 四川仁壽人, 博士/副教授, 主要研究方向: 發(fā)酵食品加工. E-mail: zxqun3447@126.com

（責(zé)任編輯 章踐立）