鐘佳勝，蒙碧珍，陳振陽，曾環(huán)想，周向榮

(國藥集團(tuán)致君(深圳)制藥有限公司，廣東 深圳 518110)

頭孢菌素類抗生素以其抗菌譜廣、殺菌力強(qiáng)、耐酸耐酶等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于臨床，近年來其用量和生產(chǎn)量呈逐年增長趨勢[1]?？股氐臑E用、醫(yī)療廢棄物的隨意丟棄以及制藥廢水的排放，導(dǎo)致水生態(tài)環(huán)境污染日益嚴(yán)重，在地下水、地表水、再生水、生活污水及城市污水廠出水中均檢出痕量的抗生素殘留[2-4]。水樣中抗生素殘留引發(fā)的毒性和耐藥性等生物安全性問題，已備受人們的廣泛關(guān)注[5]。

由于水樣中頭孢菌素的殘留濃度水平低，因此在樣品分析前需進(jìn)行富集處理。目前，文獻(xiàn)主要以固相萃取(SPE)、液液萃取(LLE)等[6-8]方法進(jìn)行富集，但存在成本高、需使用大量有機(jī)溶劑、富集效果差等缺點(diǎn)。中空纖維膜液相微萃取技術(shù)(HF-LPME)以多孔的中空纖維為微萃取溶劑的載體，集采樣、萃取和濃縮于一體，溶劑用量少，富集效果良好，是一種環(huán)境友好的綠色樣品前處理新技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于痕量分析物的樣品前處理[9-11]。由于HF-LPME較傳統(tǒng)液液萃取法的效果更好，因此通常與高效液相色譜法(HPLC)聯(lián)用即可實(shí)現(xiàn)痕量或超痕量分析物的檢測。目前，HF-LPME/HPLC技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境、食品、藥品等領(lǐng)域的痕量分析，但鮮有應(yīng)用于頭孢菌素的報道。

本文以一代頭孢(頭孢唑林)、二代頭孢(頭孢呋辛)、三代頭孢(頭孢他定)和頭霉素類(頭孢西丁)抗生素中臨床用量較大的4種頭孢菌素為研究對象，以離子液體為萃取溶劑，通過優(yōu)化萃取條件和色譜條件，建立了水樣中痕量頭孢菌素殘留的HF-LPME/HPLC檢測方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，配備在線真空脫氣機(jī)、四元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱和紫外檢測器；PB-10 Sartorius普及型pH計(德國賽多利斯公司)；AB135-S型十萬分之一電子天平(瑞士Metter Toledo公司)；LC-DMS-H型恒溫磁力攪拌器(力辰科技有限公司)；AccurelQ 3/2聚丙烯中空纖維(壁厚200 μm，孔徑0.2 μm，內(nèi)徑600 μm，Membrana GmbH，德國)。

1.2 試藥與試劑

頭孢唑林(CZO)、頭孢呋辛(CXM)、頭孢他定(CAZ)和頭孢西丁(FOX)對照品購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈(色譜純)購自美國Fisher Scientific公司；1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([Bmin]PF6)、1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([Hmin]PF6)、1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([Omin]PF6)和三正辛基氧膦(TOPO)購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；醋酸鈉、冰醋酸及其他試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用超純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備。

1.3 樣品制備方法

將中空纖維膜置于丙酮中超聲清洗后自然晾干，截取成長度為8 cm的小段，將膜端熱封并浸入萃取溶劑(含10%TOPO的[Omin]PF6)中超聲2 h。取出中空纖維膜，用超純水沖洗以去除殘留的離子液體。將處理后的中空纖維膜置于10 mL樣品溶液(pH 2.5)中，并置于恒溫磁力攪拌器中萃取20 min，溫度和轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為30 ℃和600 r/min。取出中空纖維膜并剪開，用50 μL甲醇將接受相吹出并置于液相小瓶配套微量內(nèi)襯管中，待分析。

1.4 色譜條件

采用Agilent Poroshell 120 EC-C18(100 mm×4.6 mm，2.7 μm)色譜柱；以0.05 mol/L醋酸鈉緩沖液(用冰醋酸調(diào)至pH 4.0)-乙腈(9∶1，體積比)為流動相；流速為1.0 mL/min；柱溫為40 ℃；檢測波長為254 nm；進(jìn)樣體積為10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 HF-LPME條件的優(yōu)化

2.1.1 萃取溶劑的選擇由于頭孢菌素類化合物的水溶性較強(qiáng)，因此傳統(tǒng)有機(jī)溶劑對其的萃取效果差。離子液體因具有獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，萃取效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)溶劑，且對有機(jī)酸等水溶性強(qiáng)的化合物具有良好的富集效果[12]，因此本實(shí)驗(yàn)考察了分別以離子液體[Bmin]PF6、[Hmin]PF6和[Omin]PF6為萃取溶劑時對目標(biāo)化合物萃取率的影響。結(jié)果顯示：離子液體的碳鏈越長，目標(biāo)化合物的萃取效果越好，其中以[Omin]PF6的萃取效果最好?？赡苁且?yàn)殡S著碳鏈的增長離子液體的極性增大，根據(jù)相似相溶原理，強(qiáng)極性的頭孢菌素類化合物在其中的分配系數(shù)越大。因此選擇采用[Omin]PF6為萃取溶劑。

圖1 TOPO濃度對萃取率的影響Fig.1 Effect of concentration of TOPO on extraction efficiency

圖2 樣品溶液pH值對萃取率的影響Fig.2 Effect of pH value of sample solution on extraction efficiency

圖3 萃取時間對萃取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction efficiency

2.1.2 輔助萃取溶劑的選擇由于頭孢菌素類化合物的親水性強(qiáng)，直接采用[Omin]PF6進(jìn)行萃取的效果一般。據(jù)報道，在離子液體中加入TOPO可提高萃取效果，其原理為TOPO可與目標(biāo)化合物發(fā)生氫鍵作用，從而增大其在離子液體中的分配系數(shù)[13]。本實(shí)驗(yàn)考察了不同濃度TOPO對目標(biāo)化合物萃取率的影響，由圖1可知：加入TOPO后各目標(biāo)化合物的萃取率明顯提高，當(dāng)TOPO濃度為10%時趨于穩(wěn)定，綜合考慮萃取效果和成本，選擇在離子液體中添加10%的TOPO作為輔助萃取溶劑。

2.1.3 樣品溶液pH值的選擇CZO、CXM、CAZ和FOX分子的β-內(nèi)酰胺母核上游離羧基的pKa值分別約為2.5、2.5、1.8和3.5，其在水溶液中主要以離子態(tài)存在，根據(jù)相似相溶原理，此時萃取效率低。因此，樣品溶液需先調(diào)節(jié)pH值，使目標(biāo)化合物主要以分子態(tài)存在。本實(shí)驗(yàn)以硫酸為酸化劑，結(jié)合各目標(biāo)化合物的pKa值，考察了樣品溶液的pH值分別為1.5、2.0、2.5、3.0和3.5時對萃取率的影響(見圖2)。結(jié)果顯示：隨著pH值的降低，目標(biāo)化合物的萃取率明顯增加，但pH值低于2.5時萃取率反而降低。因此選擇以硫酸調(diào)節(jié)樣品溶液的pH值為2.5。

2.1.4 鹽濃度的影響在樣品溶液中加入適量的鹽可以提高萃取效率，這是由于鹽析效應(yīng)使大量的自由離子發(fā)生水合作用，導(dǎo)致自由水分子減少，從而促進(jìn)目標(biāo)化合物進(jìn)入萃取溶劑中。本實(shí)驗(yàn)考察了加入不同濃度的NaCl和Na2SO4對目標(biāo)化合物萃取率的影響，結(jié)果表明，鹽的加入對萃取效率的影響不大，因此選擇在樣品溶液中不加入鹽。

2.1.5 萃取時間的影響目標(biāo)化合物在樣品溶液和萃取溶劑之間達(dá)到分配平衡需要一定的時間。隨著萃取時間的增加，目標(biāo)化合物在兩者之間的分配通常會趨于平衡，萃取率趨于穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)考察了萃取時間分別為5、10、15、20、30 min時對目標(biāo)化合物萃取率的影響，由圖3可知，當(dāng)萃取時間為20 min時，萃取率整體較高且趨于穩(wěn)定。為兼顧萃取時間和萃取效率，實(shí)驗(yàn)選擇萃取時間為20 min。

2.1.6 萃取溫度的影響提高萃取溫度可以加劇分子的運(yùn)動，增大目標(biāo)化合物在兩相中的擴(kuò)散系數(shù)和擴(kuò)散速率，從而縮短分配平衡時間，提高萃取效率?？疾炝瞬煌腿囟?25、30、35、40、45 ℃)對目標(biāo)化合物萃取率的影響，結(jié)果顯示，萃取溫度對萃取率的影響較小。考慮到頭孢菌素對溫度敏感，高溫易導(dǎo)致其發(fā)生降解，結(jié)合環(huán)境溫度、儀器性能參數(shù)，最終選擇萃取溫度為30 ℃。

2.1.7 攪拌速率的影響攪拌樣品溶液可以改善傳質(zhì)過程，加快目標(biāo)化合物進(jìn)入萃取溶劑的速度，進(jìn)而縮短分配平衡時間，提高萃取效率?？疾炝瞬煌瑪嚢杷俾?300、400、500、600、700 r/min)對目標(biāo)化合物萃取率的影響，結(jié)果表明，當(dāng)攪拌速率為600 r/min時，各目標(biāo)化合物的萃取率最高，繼續(xù)提高攪拌速率，萃取效率反而略有下降。因此選擇樣品溶液的攪拌速率為600 r/min。

2.2 色譜條件的選擇

本實(shí)驗(yàn)考察了Inertsil ODS-3(150 mm×4.6 mm，5 μm)和Agilent Poroshell 120 EC-C18(100 mm×4.6 mm，2.7 μm)2種色譜柱對4種頭孢菌素的分離效果。結(jié)果表明：采用填料粒徑為5 μm的Inertsil ODS-3色譜柱時，CXM和CZO無法基線分離；而采用填料粒徑為2.7 μm的Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱時，4種頭孢菌素的分離效果良好，且柱效和分離效率均較高，因此選作本實(shí)驗(yàn)的色譜柱。結(jié)合文獻(xiàn)[14-16]，經(jīng)過優(yōu)化發(fā)現(xiàn)以0.05 mol/L醋酸鈉緩沖液(pH 4.0)-乙腈(9∶1)為流動相時，4種頭孢菌素的分離效果良好，最終確定以其作為流動相。采用所建立的HPLC方法，在7 min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)4種頭孢菌素的分離檢測。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性關(guān)系、檢出限與定量下限分別取CZO、CXM、CAZ和FOX對照品適量，精密稱定，用水配制成系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，按本方法處理和測定。分別以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x，ng/mL)，峰面積值為縱坐標(biāo)(y)，采用最小二乘法進(jìn)行線性回歸分析，并以信噪比(S/N)為3或2時對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為檢出限(LOD)，以信噪比(S/N)為10時對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為定量下限(LOQ)，結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，各目標(biāo)化合物的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99，檢出限為0.2～0.7 ng/mL，定量下限為0.5～2.8 ng/mL，方法靈敏度與固相萃取法相當(dāng)[17]。

表1 4種頭孢菌素的線性關(guān)系、檢出限及定量下限Table 1 Linear relationships,LODs and LOQs of four cephalosporin antibiotics

2.3.2 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差取環(huán)境水樣(即表3中樣品4)分別加入不同濃度的CZO、CXM、CAZ和FOX混合對照品溶液進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每個濃度平行配制6份樣品，結(jié)果如表2所示。4種頭孢菌素的回收率為83.2%～102%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.0%～9.8%，表明方法的準(zhǔn)確度和重復(fù)性良好。

表2 4種頭孢菌素的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Recoveries and relative standard deviations of four cephalosporin antibiotics(n=6)

表3 水樣中4種頭孢菌素的測定結(jié)果Table 3 Determination results of four cephalosporin antibiotics in water ρ/(ng·mL-1)

* no detected

2.4 富集倍數(shù)

按照公式E=Co,eq/Ci計算HF-LPME的富集倍數(shù)，式中E為富集倍數(shù)，Co,eq為經(jīng)HF-LPME萃取后在萃取溶劑中目標(biāo)化合物的濃度，Ci為萃取前樣品溶液中目標(biāo)化合物的初始濃度。結(jié)果表明，4種頭孢菌素的富集倍數(shù)為45 ～78倍，表明所建立的HF-LPME法對4種頭孢菌素具有良好的富集效果。

圖4 樣品經(jīng)HF-LPME處理前(a)和處理后(b)的色譜圖Fig.4 Chromatograms of sample before(a) and after(b) HF-LPME treatment

2.5 樣品測定

采用所建立的方法對不同來源的水樣進(jìn)行測定，如表3所示。其中，水樣1來源于某污水處理廠，水樣2來源于污水處理廠出水口，水樣3由水樣1經(jīng)實(shí)驗(yàn)室新型污水處理技術(shù)處理后所得，水樣4、水樣5和水樣6取自公開水域或水系。水樣1經(jīng)HF-LPME處理前后的HPLC色譜圖如圖4所示。結(jié)果表明，所建立的方法能夠有效檢出水樣中的4種頭孢菌素殘留。經(jīng)處理后的污水中其殘留量顯著降低，但在公開水域或水系中仍檢出痕量頭孢菌素殘留。

3 結(jié) 論

本文建立了基于中空纖維膜的液相微萃取結(jié)合高效液相色譜測定水樣中4種頭孢菌素含量的分析方法。結(jié)果表明，本方法對4種頭孢菌素的萃取效果良好，富集倍數(shù)達(dá)45～78倍，檢出限為0.2～0.7 ng/mL，回收率為83.2%～102%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.0%～9.8%。該方法簡單高效，綠色環(huán)保，靈敏度高，富集能力強(qiáng)，可用于水樣中痕量頭孢菌素殘留的測定。