季芯羽，葉 泰，袁 敏，曹 慧，徐 斐，于勁松，任 華，葉寅穎，李嘉怡，王彥茜

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093)

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是人工合成的一類新型仿生農(nóng)藥，具有廣譜、高效、高環(huán)境相容性等特點[1]，近年來，被當(dāng)作高毒性殺蟲劑如有機氯和有機磷殺蟲劑的替代品，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中害蟲的防控[2]。然而，殘留的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥會損傷人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，且會對內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生干擾[3]。間苯氧基苯甲酸(3-Phenoxybenzoic acid，3-PBA)與間苯氧基苯甲醛(3-Phenoxybenzaldehyde，3-PBD)是大多數(shù)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的主要代謝物，因此常通過檢測3-PBA或3-PBD來探知擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的殘留情況[4-5]。而相比于3-PBA，3-PBD能在較低水平上誘導(dǎo)人類心臟細(xì)胞中的DNA損傷和理化變化[6]，因此對3-PBD的檢測更為重要。當(dāng)前對3-PBD的檢測多集中于色譜法[7-8]，其樣品前處理步驟繁瑣，無法滿足3-PBD快速檢測的需求。

分子印跡技術(shù)(Molecular imprinting technology，MIT)是針對目標(biāo)分子通過共價或非共價作用構(gòu)筑有效的印跡空腔，從而實現(xiàn)對目標(biāo)分子選擇性識別的技術(shù)[9]，分子印跡聚合物(Molecularly imprinted polymers，MIPs)具有良好的物理/化學(xué)穩(wěn)定性、高特異性、低成本、易于制備等優(yōu)點，因此作為傳感器的識別單元得到了廣泛應(yīng)用[10-11]。而量子點(Quantum dots，QDs)與分子印跡相結(jié)合的技術(shù)，通過將QDs包埋到MIPs內(nèi)，不僅提高了熒光信號的穩(wěn)定性，還可利用分子印跡特異性的識別空腔，實現(xiàn)對目標(biāo)分子的高靈敏、高特異性的快速檢測[12]。目前，Mn 摻雜ZnS QDs由于毒性低、制備簡便而廣泛用于熒光分子印跡技術(shù)中[13]。

本文基于Mn摻雜ZnS QDs，以3-PBD為模板分子，采用溶膠-凝膠法成功合成了分子印跡熒光傳感器(QDs-MIPs)，基于3-PBD選擇性結(jié)合于印跡空腔后可猝滅QDs-MIPs熒光的原理，構(gòu)建了快速檢測3-PBD的新方法。此外，基于擬除蟲菊酯類農(nóng)藥酶解產(chǎn)物，以氰戊菊酯為模型，驗證了該傳感器應(yīng)用于擬除蟲菊酯類農(nóng)藥檢測的可行性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

RF-6000熒光分光光度計(日本島津儀器公司)；PB-10酸度計(賽多利斯科學(xué)儀器公司)；H-1650離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；K-Alpha X 射線光電子能譜儀、FT-IR傅立葉紅外變換光譜儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)；Smartlab9X射線衍射儀(日本理學(xué)株式會社)；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Color squid white磁力攪拌器(德國IKA有限公司)；BZF30真空干燥箱(上海博迅有限公司)。

3-PBD(98%)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-Aminopropyl triethoxysilane，APTES)、四乙氧基硅烷(Tetraethyl orthosilicate，TEOS)、(3-巰基丙基)三甲氧基硅烷((3-Mercaptopropyl)methyldimethoxysilane，MPTS)、磷酸二氫鈉(99%)、磷酸氫二鈉(99%)均購自美國西格瑪公司；氨水、無水乙醇、甲醇、硫酸鋅七水合物(ZnSO4·7H2O)，氯化錳(Ⅱ)四水合物(MnCl2·4H2O)、硫化鈉九水合物(Na2S·9H2O)購自上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；氰戊菊酯、醚菊酯、氯氰菊酯均購于上海農(nóng)藥研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 MPTS包被的Mn摻雜ZnS QDs的合成MPTS包被的Mn摻雜ZnS QDs的合成方法參考Wang等的研究[14]。向燒瓶中加入12.5 mmol ZnSO4·7H2O、1 mmol MnCl2·4H2O和40 mL雙蒸水，將混合物室溫下于氮氣氣氛下攪拌10 min后，滴加10 mL含有12.5 mmol Na2S·9H2O的水溶液，并繼續(xù)攪拌30 min。然后加入10 mL 0.625 mmol MPTS的乙醇溶液，并將混合物于黑暗中攪拌20 h。將得到的MPTS包被的Mn摻雜ZnS QDs離心，并用雙蒸水和無水乙醇洗滌3次，然后真空干燥過夜。

1.2.2 QDs-MIPs的制備向燒瓶中加入10 mL 乙醇與19 μL 3-PBD，混合均勻。加入120 μL APTES，攪拌30 min，再加入1 mL TEOS，攪拌5 min。向混合物中加入400 mg MPTS包被的量子點和2 mL 6%的氨水溶液，室溫下攪拌16 h。用甲醇洗滌模板后，再用水洗滌3次，然后真空干燥，烘干待用。非分子印跡熒光聚合物(QDs-NIPs)的制備方法同上述方法一致，但不加入模板分子。

1.3 QDs-MIPs熒光響應(yīng)性能研究

將20 μg QDs-MIPs或QDs-NIPs超聲分散于5 mL磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 8.0，5 mmol/L)中。分別取500 μL QDs-MIPs或QDs-NIPs溶液與500 μL不同濃度的3-PBD(0.3～50 μmol/L)溶液于25 ℃振蕩混合8 min，在340 nm激發(fā)波長條件下(狹縫寬度10 nm)記錄600 nm處的熒光強度。

1.4 氰戊菊酯的測定

有研究顯示，羧酸酯酶能夠水解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥[15]，本課題組在之前的工作中采用生物礦化策略制備的豬肝酯酶雜化“納米花”具有較高的酶活力，并能高效地水解菊酯類農(nóng)藥。豬肝酯酶雜化“納米花”制備參照課題組前期研究[16]。以氰戊菊酯作為擬除蟲菊酯類農(nóng)藥模型，用QDs-MIPs對其濃度進行測定。配制不同濃度的氰戊菊酯(0.5～5 μmol/L)，并與1 mL含2 mg/mL“納米花”的PBS溶液(pH 8.0，5 mmol/L)混合，45 ℃條件下水解20 min。將水解產(chǎn)物離心，取上清液500 μL與500 μL QDs-MIPs溶液(4 μg/mL)25 ℃混合振蕩8 min后測定熒光。

1.5 實際樣品的分析

為了驗證QDs-MIPs對實際樣品的應(yīng)用能力，分別對梨、大白菜、小麥粉進行加標(biāo)檢測。從上海當(dāng)?shù)爻匈徺I新鮮的黃金梨，榨汁后依次通過離心、玻璃漏斗過濾和0.2 μm濾膜過濾除去沉淀物，將得到的汁液稀釋10倍，調(diào)至pH 8.0，進行加標(biāo)實驗；購買新鮮的大白菜，將其用雙蒸水-乙腈(體積比9∶1)混合液浸泡30 min后，取浸提液調(diào)至pH 8.0，進行加標(biāo)實驗；購買小麥粉，用雙蒸水-乙腈(體積比9∶1)混合液浸泡30 min后，取浸提液依次通過離心、0.2 μm濾膜過濾除去懸浮顆粒，將得到的汁液稀釋10倍，調(diào)至pH 8.0，進行加標(biāo)實驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 QDs-MIPs的制備及表征

QDs-MIPs合成過程如圖1所示。其中，MPTS既作為量子點合成的穩(wěn)定劑，又用以形成二氧化硅(SiO2)涂層以穩(wěn)定量子點的熒光[17]。以合成的MPTS包被的Mn摻雜ZnS QDs為載體，3-PBD為模板，APTES為功能單體，TEOS為交聯(lián)劑，通過溶膠-凝膠反應(yīng)形成印跡層，經(jīng)甲醇洗脫后留下具有特殊印跡空腔的QDs-MIPs。其檢測機理是，帶有空腔的QDs-MIPs通過非共價相互作用結(jié)合目標(biāo)分子3-PBD，隨后QDs導(dǎo)帶的電荷轉(zhuǎn)移到3-PBD的最低未占分子軌道上，從而引起QDs-MIPs熒光強度的猝滅。

圖1 QDs-MIPs合成原理圖Fig.1 Synthesis schematic of the QDs-MIPs

采用X射線光電子能譜(X-ray photoelectron spectroscopy，XPS)對量子點及其印跡聚合物進行表征。QDs及QDs-MIPs的XPS圖(圖2A)顯示出Si2p(103 eV)、S2p(162 eV)、C1s(285 eV)、N1s(399 eV)、O1s(532 eV)、Mn2p(638 eV)、Zn2p(1 021 eV)的強烈信號，證實Mn摻雜ZnS QDs和QDs-MIPs已成功制備。對N1s進行分峰處理，結(jié)果見圖2B，N1s的XPS光譜中顯示兩個峰，主峰在399 eV，可歸因于N—H結(jié)構(gòu)，較小的峰在～400 eV，可歸因于C—N結(jié)構(gòu)。

MPTS包被的Mn摻雜ZnS QDs和QDs-MIPs的X射線衍射(X-ray diffraction，XRD)圖譜(圖2C)顯示，兩者均具有(111)、(220)和(311)晶面，屬立方結(jié)構(gòu)(或閃鋅礦)。QDs-MIPs(111)面衍射峰的強度弱于ZnS QDs的原因是，QDs-MIPs比ZnS QDs含有更多的無定形材料(SiO2)。

為進一步驗證QDs-MIPs的成功合成，對QDs、QDs-MIPs和QDs-MIPs+3-PBD進行紅外光譜掃描(Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR)(圖2D)。1 066 cm-1附近的強寬峰為Si—O—Si的不對稱拉伸振動，790 cm-1處為Si—O的伸縮振動；2 929 cm-1處脂肪族C—H的拉伸帶和3 421 cm-1處的N—H帶表明存在氨基丙基，說明APTES成功接枝到MPTS包被的QDs表面;1 486 cm-1附近的峰歸因于3-PBD結(jié)構(gòu)中苯環(huán)的骨架振動，移除模板后，1 486 cm-1附近的峰值減小，表明在MIPs上獲得了特定的識別腔。

2.2 檢測條件優(yōu)化

考察了不同pH值對QDs-MIPs熒光強度變化的影響，結(jié)果如圖3A所示。pH<8.0時，隨著pH值的減小，傳感器的響應(yīng)降低；pH>8.0時，SiO2殼會被電離而導(dǎo)致表面缺陷，使得3-PBD對QDs-MIPs的熒光猝滅明顯降低。因此選擇pH 8.0進行后續(xù)研究。

進一步考察了不同作用時間對QDs-MIPs熒光強度變化的影響，圖3B為QDs-MIPs與5 μmol/L 3-PBD作用不同時間的熒光強度變化情況。結(jié)果顯示，隨著作用時間的延長，熒光猝滅值逐漸增大，兩者相互作用8 min時QDs-MIPs熒光猝滅值達到平衡。因此，選擇8 min作為最佳作用時間。

2.3 QDs-MIPs及QDs-NIPs對3-PBD的熒光響應(yīng)

在最優(yōu)條件下，考察了不同濃度3-PBD(0.3～50 μmol/L)對QDs-MIPs熒光強度的影響。隨著3-PBD濃度的逐漸增加，QDs-MIPs對3-PBD的特異性吸附增加，其熒光強度逐漸降低。以ΔIF(即IF0-IF)為縱坐標(biāo)(y)，3-PBD濃度為橫坐標(biāo)(x)作校準(zhǔn)曲線，得到線性方程y=21.61x+93.54(r2=0.998)。3-PBD濃度在0.3～5 μmol/L范圍內(nèi)與ΔIF呈良好線性關(guān)系，檢出限(依據(jù)3Sb/K計算，其中K是校準(zhǔn)曲線的斜率，Sb是空白標(biāo)準(zhǔn)偏差)為0.267 μmol/L。

同時考察了不同濃度3-PBD(3～50 μmol/L)對QDs-NIPs熒光強度的影響。由于QDs-NIPs不能特異性吸附3-PBD，因此3-PBD濃度較低時，QDs-NIPs的熒光強度幾乎重合。隨著3-PBD濃度的增加，QDs-NIPs的熒光發(fā)生一定程度的猝滅，且3-PBD濃度(x)在10～50 μmol/L范圍內(nèi)與ΔIF(y)呈線性關(guān)系，線性方程為y=2.05x+83.55(r2=0.984)。

圖4 QDs-MIPs和QDs-NIPs的選擇性Fig.4 Selectivity of QDs-MIPs and QDs-NIPs

2.4 QDs-MIPs的特異性研究

為了評價所合成的QDs-MIPs的選擇性，以5 μmol/L菊酯類農(nóng)藥醚菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯，煙堿類農(nóng)藥吡蟲啉、噻蟲啉，有機磷類農(nóng)藥樂果、苯線磷進行熒光響應(yīng)測定。結(jié)果顯示(圖4)，QDs-MIPs對3-PBD有較強響應(yīng)能力，對其他擬除蟲菊酯類農(nóng)藥也有一定的響應(yīng)，但對煙堿類農(nóng)藥和有機磷類農(nóng)藥的響應(yīng)較弱。由于QDs-NIPs上不存在特異性吸附位點，因此對上述物質(zhì)幾乎沒有響應(yīng)。

表1 實際樣品的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 1 Recoveries and relative standard deviations of 3-PBD for spiked samples(n=5)

2.5 氰戊菊酯的測定

本課題組前期研究表明豬肝酯酶雜化“納米花”能夠高效水解菊酯類農(nóng)藥[16]，因此將制備的QDs-MIPs與酶水解相結(jié)合，以實現(xiàn)對菊酯類農(nóng)藥的快速檢測。以ΔIF為縱坐標(biāo)(y)，氰戊菊酯濃度(x)為橫坐標(biāo)作校準(zhǔn)曲線，得到線性方程y=38.55x+97.79(r2=0.994)。結(jié)果顯示，氰戊菊酯在0.5～5 μmol/L濃度范圍內(nèi)與ΔIF呈良好線性關(guān)系，檢出限(依據(jù)3Sb/K計算)為0.246 μmol/L(即0.1 mg/kg)。根據(jù)GB2763-2016對水果中氰戊菊酯最大殘留限量為0.2～1 mg/kg的規(guī)定[18]，本方法能滿足相關(guān)測定需要。

2.6 實際樣品測定

對經(jīng)前處理的梨、大白菜、小麥粉進行3個水平的加標(biāo)實驗，每個水平平行測定5次，結(jié)果如表1所示。其回收率為84.0%～119%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)不超過5.0%。

3 結(jié) 論

本文采用溶膠-凝膠法制備了基于Mn摻雜ZnS QDs的熒光分子印跡聚合物，用于擬除蟲菊酯類農(nóng)藥代謝產(chǎn)物3-PBD的測定,并結(jié)合菊酯類農(nóng)藥酶解步驟，將其用于擬除蟲菊酯農(nóng)藥的快速檢測。結(jié)果顯示，此分子印跡熒光傳感器可用于實際樣品中3-PBD的測定。