何凱麗,楊運(yùn)云,徐 舸,向章敏*

(1.沈陽工業(yè)大學(xué) 理學(xué)院 化工系，遼寧 沈陽 110870；2.廣東省測(cè)試分析研究所 廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省原位電離質(zhì)譜分析工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510070)

溶血磷脂酰膽堿(LPCs)又稱溶血卵磷脂,是一類脂質(zhì)化合物。LPCs廣泛存在于各種生物體內(nèi)，是一類具有多種生理功能的生物活性信號(hào)分子，與動(dòng)脈粥樣硬化[1-2]、糖尿病[3]、心血管疾病[4]及癌癥[5-7]等疾病密切相關(guān)。眾多研究表明，生物體內(nèi)LPCs的含量水平可作為疾病的潛在生物標(biāo)志物[8-9]，在臨床病理研究、疾病診斷及預(yù)防等方面發(fā)揮著重要作用。

生物樣本中LPCs 的快速、準(zhǔn)確測(cè)定是臨床分析的一項(xiàng)重要任務(wù)。目前，LPCs的分析方法包括薄層色譜法(TLC)[10]、高效液相色譜法(HPLC)[11]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)[12-14]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[15-16]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[17]等。然而，這些技術(shù)均存在一定不足，如TLC在LPCs的檢測(cè)中專屬性較差，難以實(shí)現(xiàn)廣泛應(yīng)用。HPLC對(duì)復(fù)雜樣品具有良好的分離能力，但檢測(cè)靈敏度低，在目標(biāo)物濃度較低時(shí)，基質(zhì)干擾嚴(yán)重、選擇性差、分析時(shí)間長(zhǎng)，不適用于復(fù)雜生物樣品中LPCs的痕量檢測(cè)。GC-MS適用于揮發(fā)性和半揮發(fā)性物質(zhì)的分析，LPCs的檢測(cè)需要預(yù)先對(duì)樣品進(jìn)行酯化反應(yīng)，樣品前處理過程復(fù)雜，難以實(shí)現(xiàn)批量樣品檢測(cè)。因此，建立一種快速的LPCs分析檢測(cè)方法十分必要。

傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(FTICR-MS)[18-22]技術(shù)具有靈敏度高、分辨率高、準(zhǔn)確性好、分析速度快等特點(diǎn)，在化合物的精準(zhǔn)檢測(cè)方面有很大優(yōu)勢(shì)。利用FTICR-MS檢測(cè)LPCs，可極大地縮短分析時(shí)間。此外，F(xiàn)TICR-MS具有超高的分辨率以及精確的質(zhì)量準(zhǔn)度，有利于待測(cè)物精確分子量的準(zhǔn)確測(cè)定。本文建立了一種快速測(cè)定生物樣品中4種LPCs(LPC13∶0、LPC15∶0、LPC16∶0、LPC18∶0)的FTICR-MS分析方法，該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確，可滿足生物樣品中LPCs的檢測(cè)要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀(FTICR-MS SolariX XR7.0 T，德國Bruker公司)，BSA224S型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；注射器(宣城市江南醫(yī)療器械有限公司)；JP-060S型超聲波清洗機(jī)(深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司)；TG16-W離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；數(shù)據(jù)處理軟件(德國Bruker 公司，DataAnalysis 4.4)。LPCs標(biāo)準(zhǔn)品(LPC13∶0、LPC15∶0、LPC16∶0、LPC18∶0,美國Avanti Polar Lipids公司)；二氯甲烷、氯仿(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；LPCs標(biāo)準(zhǔn)品(25 mg);甲醇(色譜純，美國Honeywell公司)。

樣品：血漿與大鼠肝臟樣品(8周齡雄性SD大鼠，體重180～220 g，ID：SYXK 2014-0137)于-80 ℃下保存，分析前于室溫下解凍。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取LPC13∶0、LPC15∶0、LPC16∶0、LPC18∶0標(biāo)準(zhǔn)品各0.01 g(精確至0.000 1 g)于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。準(zhǔn)確移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于容量瓶中，用甲醇逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為0.5、1、10、50、100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，待測(cè)。

1.3 樣品前處理

1.3.1 人體血漿樣品移取0.85 mL(精確至0.001 mL)樣品于2 mL Eppendorf(EP)管中，加入1 mL甲醇-氯仿(9∶1，體積比)，渦旋萃取5 min，超聲30 min,以12 000 r/min離心15 min,靜置至室溫，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，濾液待測(cè)。

1.3.2 大鼠肝臟組織樣品將大鼠肝臟組織勻漿后，稱取0.10 g(精確至0.000 1 g)樣品于2 mL EP管中，加入1 mL甲醇-氯仿(9∶1，體積比)，渦旋萃取5 min，超聲30 min，以12 000 r/min離心15 min，靜置至室溫，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，濾液待測(cè)。

1.4 質(zhì)譜條件

采用FTICR-MS分析提取液中的LPCs。進(jìn)樣前，采用三氟乙酸鈉進(jìn)行質(zhì)量準(zhǔn)確度校正；采用250 μL微量進(jìn)樣器進(jìn)樣，流速為120 μL/h；ESI離子源；正離子模式檢測(cè)；質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 000；噴霧氣壓力(Nebulizer pressure):40 kPa；噴霧電壓(Spray capillary voltage)：4.5 kV,毛細(xì)管出口電壓：-500 V；射頻電壓：350 Vpp；霧化器(Nebulizer)：4×104Pa；干燥氣體(Dry gas)為氦氣，流速為4.0 L/min；干燥氣溫度(Drying gas temperature)：200 ℃；采集大小：2 M；累加次數(shù)：64 Scans；采集時(shí)間(Acquisition time)：0.200 s。每個(gè)樣品注入ESI源前，需提前對(duì)離子源進(jìn)行清理，直至背景信號(hào)強(qiáng)度小于105的響應(yīng)，以確保樣品的信號(hào)強(qiáng)度大于背景信號(hào)的3倍信噪比(S/N)。數(shù)據(jù)采集與分析均采用儀器配有的專用軟件進(jìn)行處理。

圖1 不同提取溶劑對(duì)LPCs提取效率的影響Fig.1 Effect of extraction solvent on extraction efficiencies of four LPCs

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取條件的優(yōu)化

由于生物樣品成分復(fù)雜，待測(cè)化合物性質(zhì)各異，本文分別考察了3種不同有機(jī)溶劑：甲醇、甲醇-二氯甲烷(9∶1，體積比)、甲醇-氯仿(9∶1，體積比)對(duì)樣品的提取效果。以血漿樣品為例，由圖1可知，甲醇對(duì)4種LPCs的提取效率最低，甲醇-氯仿(9∶1)的提取效率最高，LPC15∶0、LPC16∶0、LPC18∶0的響應(yīng)值均明顯增大，且雜質(zhì)干擾較小。為保證4種LPCs在生物樣品中得到更好的提取，本文選擇甲醇-氯仿(9∶1)為最佳提取溶劑。

圖2 溶血磷脂酰膽堿(LPCs)的分子結(jié)構(gòu)通式Fig.2 General formula of molecular structure of lysophosphatidylcholine(LPCs)

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1 檢測(cè)模式的選擇LPCs是一種帶有正電荷的極性脂質(zhì)，分子結(jié)構(gòu)通式見圖2。為確定質(zhì)譜檢測(cè)條件，本文首先對(duì)LPCs在質(zhì)譜中的檢測(cè)模式進(jìn)行優(yōu)化。選取50 μg/L LPCs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別在電噴霧離子源的正離子和負(fù)離子模式下進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，4種LPCs在正離子模式下的響應(yīng)均高于在負(fù)離子模式下的響應(yīng)，為保證檢測(cè)靈敏度，本文選擇在正離子模式下對(duì)LPCs進(jìn)行檢測(cè)。

2.2.2 定量離子的選擇為進(jìn)一步確定4種LPCs的定量離子，保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，本文分別在碰撞誘導(dǎo)解離電壓為30 V的條件下對(duì)4種LPCs在混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和血漿提取液中進(jìn)行MS/MS分析，結(jié)果如圖3所示。由該圖可知，4種50 μg/L LPCs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(圖3A)的主要二級(jí)質(zhì)譜碎片為[M+Na-59]+,其主要是由于LPCs為一類含有N原子的化合物，其N原子上存在的孤電子對(duì)容易加合鈉離子，因此得到待測(cè)物的基峰離子均為[M+Na]+。進(jìn)行MS/MS分析時(shí)，在碰撞能量的誘導(dǎo)下脫去三甲基丙胺基(59 Da),從而得到了二級(jí)碎片離子[M+Na-59]+。此外，血漿提取液的MS/MS質(zhì)譜圖(圖3B)中4種LPCs均能得到相應(yīng)的二級(jí)碎片離子[M+Na-59]+，進(jìn)一步證實(shí)了4種LPCs的定量離子為[M+Na]+。

2.2.3 質(zhì)譜采集參數(shù)的優(yōu)化在正離子檢測(cè)模式下，對(duì)采集兆數(shù)(Size)、采集時(shí)間(Accumulative time)和采集次數(shù)(Scans)進(jìn)行優(yōu)化，以化合物的[M+Na]+峰為定量離子，優(yōu)化后的定量離子、采集兆數(shù)、采集時(shí)間等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 待測(cè)物質(zhì)的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of tested components

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性范圍、檢出限與定量下限在優(yōu)化條件下，采用FTICR-MS法對(duì)“1.2”配制的混合溶液進(jìn)行測(cè)定，以LPC13∶0、LPC15∶0、LPC16∶0、LPC18∶0的質(zhì)量濃度(x，μg/L)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)定量離子的質(zhì)譜豐度(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2，由表2可知,LPC13∶0、LPC15∶0、LPC16∶0、LPC18∶0在0.5～100 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.993 0～0.998 3。采用基質(zhì)樣品加標(biāo)方法，通過計(jì)算其樣品加標(biāo)的響應(yīng)與背景噪音的比值分別確定檢出限(LOD,S/N=3)和定量下限((LOQ,S/N=10)，得到4種LPCs的LOD為0.02～0.03 μg/L，LOQ為0.07～0.1 μg/L，日內(nèi)精密度(Intra-RSD,n=6)為3.3%～4.3%，日間精密度(Inter-RSD,n=3d)為5.5%～9.3%，方法的靈敏度和準(zhǔn)確性可滿足復(fù)雜生物樣品的檢測(cè)要求。

表2 4種LPCs的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)(r2)、檢出限、定量下限及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Linear equations,linear ranges,correlation coefficients(r2 ),LODs,LOQs and RSDs of four LPCs

2.3.2 專屬性將本方法用于20 μg/L LPCs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和血漿中4種LPCs的分析(見圖4)。從圖中可以看出，采用本方法進(jìn)行測(cè)定時(shí)，無論是在低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，還是在血漿樣品提取液中，4種LPCs均有較好的響應(yīng)。

2.3.3 回收率結(jié)果為驗(yàn)證該方法對(duì)不同生物樣品的適用性，選取兩種不同的生物樣品(人類血漿、大鼠肝臟)分別加入3個(gè)不同濃度的LPCs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)均平行測(cè)定6次。由表3可知，4種LPCs在3個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率為70.8%～95.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.2%～9.8%。以上結(jié)果表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度，且精密度和重現(xiàn)性良好。

表3 生物樣品中4種LPCs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of four LPCs mixed standards from biological samples(n=6)

2.4 實(shí)際樣品的分析

采用本文建立的方法對(duì)5只健康大鼠(HR,藍(lán)色片段)以及5只通過高脂飲食造模所得的患有脂肪肝的大鼠(FLR,棕色片段)對(duì)照組進(jìn)行LPC13∶0、LPC15∶0、LPC16∶0、LPC18∶0檢測(cè)。該方法中5組健康大鼠(HR)與脂肪肝大鼠(FLR)肝臟內(nèi)4種LPCs的檢測(cè)結(jié)果如表4所示。

表4 健康大鼠(HR)與脂肪肝大鼠(FLR)肝臟內(nèi)4種LPCs的質(zhì)譜豐度Table 4 MS spectra abundance of four LPCs in the livers of healthy rats(HR) and fatty liver rats(FLR) (×107)

由表4可知，健康大鼠(HR)與脂肪肝大鼠(FLR)肝臟內(nèi)對(duì)應(yīng)的4種LPCs中，均以LPC16∶0的豐度最高，其余依次為L(zhǎng)PC18∶0>LPC13∶0>LPC15∶0。相對(duì)于健康大鼠(HR)，脂肪肝大鼠(FLR)肝臟內(nèi)LPC16∶0的豐度無明顯變化，但LPC13∶0、LPC15∶0和LPC18∶0的豐度降低較為明顯，其中LPC13∶0的豐度減低近50%。為使結(jié)果更加清晰，采用熱圖對(duì)5組大鼠肝臟內(nèi)4種LPCs含量進(jìn)行進(jìn)一步的對(duì)比分析，比較結(jié)果如圖5所示。

圖5 健康大鼠(HR)與脂肪肝大鼠(FLR)肝臟內(nèi)4種LPCs含量的熱圖Fig.5 Heatmap of four LPCs contents in the livers of healthy rats(HR) and fatty liver rats(FLR)

由圖5可知，熱圖在實(shí)際樣品的分析中，能適用于多組別樣品和目標(biāo)物的綜合分析，具有可視化比較4種LPCs相對(duì)濃度的優(yōu)勢(shì)，柱狀圖和行狀圖分別代表不同組別的大鼠和LPCs的相對(duì)含量。不同顏色顯示出每只大鼠肝臟中不同水平的LPCs，從紅色到綠色，LPCs含量逐漸升高。同時(shí)可觀察到，相比于健康大鼠，患有脂肪肝的大鼠肝臟中的LPC13∶0、LPC15∶0、LPC16∶0、LPC18∶0含量均有降低，且LPC13∶0、LPC15∶0的含量最少。

3 結(jié) 論

本研究建立了FTICR-MS檢測(cè)生物樣品中4種LPCs的分析方法。樣品采用甲醇-氯仿(9∶1,體積比)進(jìn)行超聲提取,通過利用高分辨率FTICR-MS，實(shí)現(xiàn)了4種LPCs的高靈敏、高準(zhǔn)確檢測(cè)，并成功應(yīng)用于實(shí)際樣品。該方法操作簡(jiǎn)單，質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果更為靈敏、準(zhǔn)確，回收率高，精密度好，可滿足生物樣品中LPC13∶0、LPC15∶0、LPC16∶0、LPC18∶0的檢測(cè)要求。