王曉輝，徐濤濤, 2，黃軼群，歐已銘, 4，賴(lài)克強(qiáng), 2，樊玉霞, 2*

1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306 2. 上海海洋大學(xué)食品熱加工工程技術(shù)研究中心，上海 201306 3. 長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410076 4. 上海中僑職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品學(xué)院，上海 201514

引 言

酸性橙Ⅱ(2-萘酚偶氮對(duì)苯磺酸鈉)屬于化工染料，工業(yè)上主要用羊毛、皮革、蠶絲、紙張的染色，醫(yī)學(xué)上常用于組織切片的染色。由于其具有致癌致畸性，酸性橙Ⅱ被禁止添加于食品中。因其色澤鮮艷、著色力強(qiáng)、價(jià)格低廉，仍有商家為降低成本將其用于辣椒粉、腐竹、鹵肉或者烤鴨的著色，引起人體中毒[1]。目前，檢測(cè)酸性橙等色素類(lèi)物質(zhì)的方法主要有高效液相色譜法[2-3]、薄層色譜掃描法[4]、紫外吸收光譜法[5]和酶聯(lián)免疫吸附法[6]等，這些方法存在前處理復(fù)雜、分析時(shí)間較長(zhǎng)、靈敏度不高等缺點(diǎn)。表面增強(qiáng)拉曼光譜(surface enhanced Raman spectroscopy, SERS)作為一種新興的分子光譜技術(shù)，具有快速、靈敏、指紋識(shí)別等特點(diǎn)，該技術(shù)在細(xì)胞檢測(cè)[7]、醫(yī)學(xué)診斷[8]、微生物識(shí)別[9]、痕量化學(xué)物質(zhì)檢測(cè)[10-11]等領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用并展現(xiàn)出廣闊的前景。

SERS信號(hào)的增強(qiáng)很大程度上取決于拉曼基底的性能，與其結(jié)構(gòu)、尺寸、形貌、粗糙程度等因素有關(guān)，常見(jiàn)的SERS增強(qiáng)基底主要有固體Q-SERS基底[12]、KlariteTM基底[13]、不同形狀金屬納米溶膠基底、各向異性納米粒子基底和化學(xué)自組裝基底[14]。納米增強(qiáng)基底因其形狀、結(jié)構(gòu)、材料等差異，對(duì)不同目標(biāo)分析物其增強(qiáng)性能也有差異。固體基底因其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，基底本身具有較好的一致性，因此其重復(fù)性較好。核殼結(jié)構(gòu)復(fù)合基底充分利用“熱點(diǎn)效應(yīng)”提高其增強(qiáng)性能。金納米棒是最近研究熱門(mén)的SERS基底之一，由于避雷針等電磁增強(qiáng)效應(yīng)，能使分析物SERS信號(hào)增強(qiáng)，從而提高分析方法的靈敏度。本研究基于SERS光譜結(jié)合不同納米材料增強(qiáng)基底對(duì)酸性橙Ⅱ進(jìn)行了檢測(cè)研究。對(duì)比了不同激光激發(fā)光源的影響，分析了不同納米材料基底增強(qiáng)性能差異，并基于不同基底對(duì)酸性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)溶液系列濃度進(jìn)行了檢測(cè)，建立了定量分析模型。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

標(biāo)準(zhǔn)品酸性橙(純度≥98%)購(gòu)置于Sigma-Aldrich公司。納米材料制備所需試劑包括十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)(純度99%)、氯金酸(純度99.99%)、L-抗壞血酸(純度>99.9%)、硼氫化鈉(純度≥99%)、硝酸銀(純度>99%)等購(gòu)置于Sigma-Aldrich和百靈威科技有限公司。使用Nicolet DXR顯微共聚焦拉曼光譜儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)獲取樣品光譜，采用JEM-2100F型場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)對(duì)納米材料進(jìn)行表征。

1.2 方法

1.2.1 金納米材料的制備

(1)金納米顆粒溶膠

根據(jù)Frens方法[15]，取50 mL氯金酸(2×10-4mol·L-1)溶液置于100 mL圓底燒瓶中，油浴中攪拌加熱至沸騰，加入0.74 mL檸檬酸鈉(1%W/W)，攪拌加熱至酒紅色，制備出粒徑約為(18.0±2.0) nm的金納米溶膠，自然冷卻至室溫保存?zhèn)溆谩Ｍㄟ^(guò)調(diào)整檸檬酸鈉的用量可制備不同粒徑的金納米顆粒溶膠。

(2)金納米棒溶膠

參照文獻(xiàn)[16]硝酸銀輔助種子生長(zhǎng)法制備。首先，金種制備過(guò)程： 在10 mL 0.1 mol·L-1CTAB溶液中加入2.5×10-4mol·L-1氯金酸和600 μL 0.01 mol·L-1冰浴的硼氫化鈉溶液，劇烈攪拌10 min后，25 ℃陳化2.5 h。

金納米棒合成： 在CTAB (9.5 mL, 0.1 mol·L-1)溶液中, 依次加入硝酸銀(20 μL, 0.01 mol·L-1), 氯金酸(0.5 mL, 0.01 mol·L-1)和抗壞血酸(55 μL, 0.1 mol·L-1)，攪拌均勻后加入12 μL制備的金種，將此混合液于27 ℃陳化14～16 h。

離心濃縮： 取1.5 mL金納米棒溶膠于離心管中，12 000 r·min-1離心10 min，去除上清液，加入超純水，再離心10 min，去除上清液，再加入一定量的超純水，渦旋混勻，待用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

酸性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品用乙腈溶解后，配成濃度為100 mg·L-1的儲(chǔ)備液，-20 ℃避光保存。用乙腈和水的混合液(1∶1,V/V)將其稀釋成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(酸性橙Ⅱ濃度范圍為0.05～10.0 mg·L-1)，密封后4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 光譜采集條件

用洗凈的玻璃片將色素標(biāo)準(zhǔn)品固體粉末平鋪均勻后采集其拉曼圖譜。將標(biāo)準(zhǔn)溶液與等量金納米顆粒溶膠，或離心濃縮后的金納米棒溶膠混勻，取5 μL于載玻片表面，50 ℃烘干后用于SERS檢測(cè)。

光譜采集條件： 波長(zhǎng)633 nm He-Ne激光源，光源功率2 mW，波長(zhǎng)為780 nm半導(dǎo)體激光源，光源功率 100 mW，曝光時(shí)間為2 s，曝光次數(shù)為3次，采集圖譜波數(shù)為400～2 000 cm-1，分辨率為4.7 cm-1。

為確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的有效性，每個(gè)濃度樣品在基底上隨機(jī)采集任意10個(gè)點(diǎn)獲得10條譜圖，平均后作為樣品光譜，在不同批次的基底上每個(gè)濃度樣品重復(fù)采集4次，獲得樣品譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 酸性橙Ⅱ的拉曼圖譜

圖1 酸性橙Ⅱ分子結(jié)構(gòu)式及固體拉曼譜圖

2.2 不同納米基底的表征

研究采用了KlariteTM金納米固體基底(Renishaw Diagnostic Ltd.英國(guó))、實(shí)驗(yàn)室制備的金納米顆粒、金納米棒溶膠基底作為SERS增強(qiáng)基底。KlariteTM固體基底外觀(guān)結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)表征如圖2所示，其表面是具有金膜覆蓋的倒金字塔納米結(jié)構(gòu)，固定于玻璃片上，增強(qiáng)活性面積為4 mm×4 mm的正方形，金膜均勻，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，具有良好的重復(fù)性。

圖2 KlariteTM基底及結(jié)構(gòu)[20]

圖3為金納米顆粒和金納米棒的透射電鏡圖。從電鏡圖中可看出合成的金納米粒子具有良好的分散性、粒徑分布較均勻。以100個(gè)納米粒子為基數(shù)計(jì)算金納米顆粒的平均粒徑為(18.0±2.0) nm，金納米棒的橫縱比為1.8[長(zhǎng)(40.1±3.8) nm，寬(21.8±2.1) nm)]。

圖3 (a)金納米顆粒和(b)金納米棒基底透射電鏡圖

2.3 SERS結(jié)合不同納米基底對(duì)酸性橙Ⅱ的檢測(cè)分析

2.3.1 不同激光光源、不同基底對(duì)酸性橙Ⅱ分析的影響

基于金納米顆粒溶膠基底，對(duì)比分析了633和780 nm兩種激光光源對(duì)酸性橙Ⅱ溶液的SERS增強(qiáng)性能。圖4為酸性橙Ⅱ基于不同激光光源的SERS譜圖。從圖4 可以看出，同一較低濃度(0.1 mg·L-1)時(shí)，兩種激光光源采集酸性橙Ⅱ的SERS信號(hào)差異不大，但780 nm的激發(fā)光源采用了更高的激光功率為100 mW，而633 nm激發(fā)光源功率只需2 mW。同等條件基于較高濃度(0.5 mg·L-1)進(jìn)一步分析，基于633 nm的激發(fā)波長(zhǎng)酸性橙Ⅱ具有更高強(qiáng)度的SERS信號(hào)。由于不同波長(zhǎng)的激光具有不同的激發(fā)能量，對(duì)不同結(jié)構(gòu)的分子，具有不同的激發(fā)效應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)生的拉曼光譜強(qiáng)度存在明顯差異。因此，該結(jié)果表明633 nm的激光光源更有利于酸性橙Ⅱ的SERS分析檢測(cè)。

在確定激光光源之后，對(duì)比分析了KlariteTM、金納米顆粒及金納米棒三種納米增強(qiáng)基底對(duì)酸性橙Ⅱ溶液的SERS增強(qiáng)效果，結(jié)果如圖5所示。不同基底獲得的酸性橙Ⅱ溶液的SERS譜圖展示出類(lèi)似的特征峰，說(shuō)明不同基底本身對(duì)酸性橙Ⅱ溶液的SERS信號(hào)響應(yīng)類(lèi)似，但不同粒徑納米顆粒基底增強(qiáng)效應(yīng)存在較明顯的差異。采用2種不同粒徑的金納米粒子對(duì)酸性橙Ⅱ進(jìn)行分析，對(duì)比發(fā)現(xiàn)，基于粒徑約為55 nm的Au納米粒子采集獲得的5 mg·L-1酸性橙Ⅱ溶液的SERS強(qiáng)度幾乎等同于粒徑約為20 nm的Au納米粒子采集獲得的1 mg·L-1酸性橙Ⅱ溶液的SERS強(qiáng)度，由此可見(jiàn)，小粒徑的納米粒子溶膠基底對(duì)酸性橙Ⅱ的SERS增強(qiáng)效果優(yōu)于大粒徑的納米粒子溶膠基底。比較KlariteTM、20 nm的金納米顆粒溶膠基底及金納米棒基底對(duì)1 mg·L-1的酸性橙Ⅱ分析，發(fā)現(xiàn)SERS強(qiáng)度差異不大，金納米顆?；自鰪?qiáng)性能稍顯優(yōu)勢(shì)，但三種基底對(duì)酸性橙Ⅱ溶液均具有較好的增強(qiáng)效果，可用于SERS分析。

圖4 酸性橙Ⅱ基于不同激光光源的SERS譜圖

圖5 基于不同納米基底酸性橙Ⅱ的SERS譜圖

2.3.2 不同基底對(duì)酸性橙Ⅱ的檢測(cè)

不同基底，因其結(jié)構(gòu)性能差異，導(dǎo)致不同結(jié)構(gòu)目標(biāo)分子在基底表面吸附行為存在差異，從而產(chǎn)生增強(qiáng)性能的差異性?；贙lariteTM金納米固體基底、金納米顆粒溶膠及金納米棒溶膠基底結(jié)合SERS對(duì)不同濃度梯度的酸性橙 Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)溶液體系進(jìn)行了檢測(cè)研究，結(jié)果如圖6所示，基于3種不同基底酸性橙Ⅱ主要特征峰峰位基本一致，隨著溶液濃度的增加，特征峰的強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。基于KlariteTM基底，濃度為0.1 mg·L-1時(shí)，多數(shù)特征峰無(wú)法識(shí)別，僅位于1 598 cm-1的特征峰可以辨別，可認(rèn)為基于KlariteTM金納米固體基底，SERS對(duì)酸性橙Ⅱ溶液的最低檢測(cè)濃度為0.2 mg·L-1。

圖6 酸性橙標(biāo)準(zhǔn)溶液的SERS檢測(cè)

Fig.6RepresentativeSERSspectraofOrangeⅡstandardsolutionsbasedon(a)KlariteTM, (b)AuNPs,and(c)AuNRs

如圖6(b)和(c)所示，基于金納米顆粒溶膠基底，酸性橙Ⅱ溶液濃度為0.1 mg·L-1時(shí)，位于467，1 231，1 498和1 596 cm-1的特征峰均可以辨別，SERS結(jié)合金納米顆粒溶膠對(duì)酸性橙Ⅱ的最低檢測(cè)濃度為0.1 mg·L-1。酸性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.1 mg·L-1時(shí)，基于金納米棒采集的SERS光譜位于988，1 184，1 385和1 597cm-1附近的特征峰仍能清晰辨認(rèn)，因此，基于金納米棒基底SERS對(duì)酸性橙Ⅱ的最低檢出濃度同為0.1 mg·L-1。

2.3.3 酸性橙Ⅱ的定量分析

SERS強(qiáng)度隨著酸性橙Ⅱ濃度的增加而增強(qiáng)，因此，嘗試建立SERS圖譜特征峰強(qiáng)度與色素濃度間線(xiàn)性回歸模型，用于酸性橙Ⅱ的定量分析。選取1 184，1 385和1 597 cm-1三個(gè)特征主峰，酸性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與單個(gè)SERS特征峰強(qiáng)度之間的線(xiàn)性回歸模型結(jié)果如表1所示。決定系數(shù)R2范圍為0.861～0.938，RMSE為0.88～1.15 mg·L-1，RPD為2.5～4.0，1 597 cm-1特征峰強(qiáng)度與濃度之間的線(xiàn)性回歸模型最佳，以上結(jié)果表明SERS可用于酸性橙Ⅱ的定量分析，為實(shí)際樣品中酸性橙Ⅱ的定量分析提供了理論依據(jù)。

表1 特征峰強(qiáng)度與酸性橙Ⅱ濃度間的線(xiàn)性回歸模型

3 結(jié) 論

應(yīng)用表面增強(qiáng)拉曼光譜結(jié)合不同納米基底對(duì)酸性橙Ⅱ進(jìn)行了檢測(cè)分析，對(duì)比了不同波長(zhǎng)激發(fā)光源對(duì)酸性橙Ⅱ的SERS檢測(cè)影響，分析了不同納米基底增強(qiáng)性能，并基于不同基底對(duì)酸性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行了檢測(cè)，該方法可為痕量酸性橙Ⅱ及同類(lèi)色素的檢測(cè)提供快速、準(zhǔn)確、靈敏的分析檢測(cè)途徑，主要結(jié)論：

(1)實(shí)驗(yàn)室自制金納米顆粒和金納米棒基底分散性良好，尺度一致； 波長(zhǎng)為633 nm的激發(fā)光源對(duì)酸性橙Ⅱ的SERS檢測(cè)更加有效； 不同粒徑金納米顆粒對(duì)酸性橙Ⅱ的增強(qiáng)性能差異顯著，小粒徑納米顆粒增強(qiáng)效果更好。

(2)SERS結(jié)合KlariteTM固體基底、粒徑為(18.0±2.0) nm的金納米顆粒，橫縱比為1.8的金納米棒對(duì)酸性橙Ⅱ的最低檢出濃度分別為0.2，0.1和0.1 mg·L-1； 基于SERS特征峰強(qiáng)度和酸性橙Ⅱ濃度相關(guān)性，建立了定量分析模型，最優(yōu)線(xiàn)性回歸模型的決定系數(shù)R2為0.933，RMSE=0.88 mg·L-1，RPD=4.0。