張文月，郝文會，趙 靜，王愈聰*

1. 河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，藥物化學(xué)與分子診斷省部共建教育部重點實驗室，河北 保定 071002 2. 河北大學(xué)綜合實驗中心，河北 保定 071002

引 言

MicroRNAs(miRNA)是一類非編碼小RNA，其長度約為20～24個核苷酸，可參與細(xì)胞內(nèi)多種生命過程，并具有重要的調(diào)節(jié)作用[1]。目前已有研究證明，miRNA的表達(dá)與多種疾病尤其是癌癥密切相關(guān)[2]，并且miRNA可以穩(wěn)定存在于生物體外周血循環(huán)過程中[3]，因此通過血液中miRNA含量的檢測可以實現(xiàn)多種疾病的早期診斷和篩選。早期miRNA通常是通過Northern印跡雜交法[4]、微陣列芯片技術(shù)[5]及實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法[6]等方法來檢測。雖然這些方法準(zhǔn)確度比較高，但均存在一定的缺陷。由于miRNA序列短并且豐度低，人們發(fā)展了多種擴增技術(shù)對其進行信號放大，滾環(huán)擴增技術(shù)(RCA)就是其中一種。該技術(shù)由Jonstrup等[7]于2006年引入到miRNA檢測中，跟傳統(tǒng)方法相比，它不需要變溫?zé)嵫h(huán)，在恒溫條件下即可達(dá)到與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)相當(dāng)?shù)撵`敏度，另外，miRNA的短序列正好與滾環(huán)擴增中掛鎖探針?biāo)枘０彘L度相匹配。因此，滾環(huán)擴增技術(shù)在miRNA檢測中受到了廣泛的關(guān)注。

陽離子共軛聚合物是由大量吸光單元共軛而成的高分子化合物，具有較強的光捕獲能力，常被用作熒光傳感探針以達(dá)到放大熒光信號的目的，進而實現(xiàn)目標(biāo)分子的高靈敏度檢測[8-10]。陽離子共軛聚合物可以和帶負(fù)電的DNA通過靜電相互作用結(jié)合，如果對DNA進行適當(dāng)?shù)臒晒鈽?biāo)記，二者可以發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)現(xiàn)象[11]，該現(xiàn)象目前已被廣泛應(yīng)用到多種生物分子的檢測中[12]。

本文將滾環(huán)擴增技術(shù)高效的信號放大作用和陽離子共軛聚合物介導(dǎo)的FRET策略結(jié)合起來，發(fā)展了一種新型的miRNA檢測方案。該方法中，首先使用目標(biāo)分子引發(fā)滾環(huán)擴增反應(yīng)，其擴增產(chǎn)物與互補序列雜交形成長序列雙鏈DNA，然后以SYBR Green Ⅰ(SG)使該DNA染色并作為FRET能量受體，此時加入陽離子共軛聚合物作為能量供體，染色后的DNA與陽離子共軛聚合物通過靜電吸附作用結(jié)合誘發(fā)強烈的FRET效應(yīng)。目標(biāo)分子與體系的FRET效率直接相關(guān)，因此通過本方案可以進行miRNA的定量檢測。由于整個檢測過程中均不需要提前標(biāo)記的探針參與，本策略在簡化方案和降低成本方面具有一定的優(yōu)勢。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

(1)儀器： PCR(2720 Thermal Cycler，美國)； Fluorolog 3-211 熒光光譜儀(Horiba Jobin-Yivon，法國)； pH計(雷磁pH S-3C型，上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

(2)試劑： T4 DNA連接酶、10×T4 buffer購于New England Biolabs，其中10×T4 buffer pH為7.5，包含MgCl2(100 mmol·L-1)，ATP(10 mmol·L-1)，Tris-HCl(500 mmol·L-1)及DTT(100 mmol·L-1)； phi29 DNA聚合酶、10×phi29 buffer購于Thermo Fisher Scientific，其中10×phi29 buffer pH為7.9，包含Mg-acetate(100 mmol·L-1)，Tris-acetate(330 mmol·L-1)，DTT(10 mmol·L-1)，Tween-20(1%)及K-acetate(660 mmol·L-1)； dNTPs及RNA酶抑制劑購于寶生物科技有限公司(中國，大連)； SYBR Green Ⅰ(20×，SG)購于廈門致善生物科技股份有限公司； 聚[(9,9-雙(6’-N，N，N-三乙基銨)己基)亞芴基亞苯基二溴化物](PFP)購于常州欣宏科生物化學(xué)有限公司； HEPES購于Sigma-Aldrich； DEPC水及試驗所用DNA均購于生工生物工程(上海)股份有限公司； 實驗中所用的miRNA均由寶生物科技有限公司(中國，大連)合成。DNA及miRNA序列如下所示： 鎖式探針，5’-P-CTACTACCTCATGGCATACAGGGAGCCAGGCATGGC-ATACAGGGAGCCAGGCAAACTATACAAC-3’； 互補鏈H1，5’-AACTATACAACCTACTACCTCA-3’； 互補鏈H2，5’-TGGCATACAGGGAGCCAGGCA-3’； Let-7a，5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’； Let-7b，5’-UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU-3’； Let-7c，5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU-3’； Let-7g，5’-UGAGGUAGUAGUUUGUACAGU-3’； Let-7i，5’-UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGU-3’； miR-21，5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’； miR-143，5’-UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC-3’。

1.2 miRNA檢測

(1) 鎖式探針成環(huán)： 分別將20 U的T4 DNA連接酶、100 nmol·L-1的鎖式探針、1× T4 buffer，0.4 U RNA酶抑制劑與目標(biāo)分子let 7a混合于10 μL體系中，然后利用PCR儀將該體系在37 ℃條件下反應(yīng)2 h，此時鎖式探針的缺口被T4 DNA連接酶連接，鎖式探針成環(huán)狀。之后，升高溫度為65 ℃，恒溫10 min，使T4 DNA連接酶失活。

(2) 滾環(huán)擴增過程： 總反應(yīng)體積為10 μL，包含2.5 μL上述反應(yīng)液、0.25 mmol·L-1dNTPs，1× phi29 buffer，0.5 U phi29 DNA 聚合酶和5 μL DEPC水，首先在30 ℃下反應(yīng)2 h，此時得到延伸產(chǎn)物長單鏈DNA。然后升高溫度為65 ℃，恒溫10 min，使phi29 DNA聚合酶失活。

(3) 延伸產(chǎn)物與互補鏈的雜交反應(yīng)： 總反應(yīng)體積為15 μL，包含上述反應(yīng)體系和濃度均為10 nmol·L-1的H1和H2。首先將反應(yīng)液升溫至95 ℃，使DNA變性3 min，然后調(diào)節(jié)溫度為30 ℃，恒溫30 min，使雜交反應(yīng)進行完全。

(4) 熒光共振能量轉(zhuǎn)移過程： 總反應(yīng)體積為100 μL，包含步驟3的反應(yīng)液、0.4×SG染料和150 nmol·L-1PFP，利用熒光光譜儀測量該反應(yīng)液的熒光光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗原理

利用陽離子共軛聚合物與染料分子SG之間的FRET作用，以滾環(huán)擴增技術(shù)作為信號放大手段，本論文設(shè)計了一種新型的miRNA檢測方法，原理如圖1所示。首先將鎖式探針與目標(biāo)分子let 7a特異性雜交，形成帶缺口的掛鎖結(jié)構(gòu)，在T4 DNA連接酶的作用下，鎖式探針閉合呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，之后在phi29 DNA聚合酶的作用下，該環(huán)狀鎖式探針從目標(biāo)分子的3’端開始滾環(huán)擴增，得到一條長單鏈DNA產(chǎn)物。H1和H2為與該擴增產(chǎn)物互補的兩條DNA鏈，因此，當(dāng)二者加入到反應(yīng)體系中時，擴增產(chǎn)物將與H1和H2雜交形成長序列的雙鏈DNA。SG是一種熒光染料，單獨存在時熒光很弱，但與雙鏈DNA結(jié)合之后則具有強烈的熒光。PFP是一種陽離子共軛聚合物，可以與雙鏈DNA因靜電吸附作用而結(jié)合。因此，在上述溶液中加入SG和PFP之后，DNA-SG雜合體與PFP緊密結(jié)合，使SG和PFP之間距離很近，由于PFP的發(fā)射峰位置正好與SG的激發(fā)峰位置重疊，因此二者可產(chǎn)生FRET效應(yīng)。如果體系中不存在目標(biāo)分子，鎖式探針將不能成環(huán)，后續(xù)的一系列反應(yīng)都將無法進行，因此體系不能產(chǎn)生FRET現(xiàn)象。目標(biāo)分子的濃度直接關(guān)系到擴增產(chǎn)物的含量，進而影響體系的FRET效率(I520/I423)，因此通過記錄體系的I520/I423值可對目標(biāo)分子進行定量檢測。

2.2 實驗條件的優(yōu)化

為了提高方法的分析檢測性能，本文對實驗條件進行了考察。

首先對鎖式探針、T4 DNA連接酶、phi29 DNA聚合酶及dNTPs的濃度進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，隨著四種反應(yīng)物濃度的增加，空白均未有明顯變化。而樣品的信號隨著四種反應(yīng)物濃度的增加，均先增加，達(dá)到最大值后變化趨緩，根據(jù)優(yōu)化結(jié)果，選擇100 nmol·L-1鎖式探針、20 U T4 DNA 連接酶、0.5 U phi29 DNA聚合酶及125 μmol·L-1dNTPs作為后續(xù)實驗的最佳用量。

圖1 基于無標(biāo)記的FRET策略檢測let 7a原理圖

然后對PFP的用量進行了優(yōu)化，結(jié)果表明，隨著PFP濃度的增加，空白的FRET效率(I520/I423)變化不大，樣品的I520/I423值呈先不變而后降低的趨勢，這是因為隨著PFP用量的增加，擴增雜交產(chǎn)物相對不足，造成沒有足夠的能量受體所致。最終選擇PFP的最佳用量為150 nmol·L-1。

2.3 對let 7a的分析性能考察

利用最優(yōu)化的實驗條件，詳細(xì)考察和評價了本文提出的方法對不同濃度let 7a的分析性能，結(jié)果如圖2所示。本實驗中FRET效率利用520 nm處和423 nm處的熒光強度比值(I520/I423)來表示，圖中將熒光光譜圖在423 nm處進行了歸一化處理，因此通過譜圖中520 nm處的熒光強度即可反映出不同濃度的let 7a所引起的FRET效率的變化。從圖2(a)可以看出，目標(biāo)分子濃度的增加可引起光譜圖中520 nm處熒光強度的持續(xù)增大，圖2(b)為目標(biāo)分子濃度和I520/I423之間的關(guān)系圖，從其內(nèi)插圖中可以看出let 7a檢測的線性范圍為0.05～5 nmol·L-1，線性方程為Δ(I520/I423)=0.14+0.10c(c/nmol·L-1,R=0.995 1)。

由于PFP具有光捕獲和光增強效應(yīng)，通?？商岣叻椒ǖ撵`敏度，為了驗證這一點，本文在無PFP參與的情況下，考察了只加入SG時系統(tǒng)的熒光強度隨著let 7a濃度的變化情況。結(jié)果表明，該方法所能檢測的最低let 7a濃度為0.2 nmol·L-1，而本文提出的FRET方案，最低let 7a檢測濃度為0.05 nmol·L-1，二者相差四倍，充分證明了PFP的加入確實達(dá)到了提高靈敏度的目的。

2.4 特異性

利用不同類型的miRNA分子作為干擾物質(zhì)，對方法的特異性進行了考察，結(jié)果如圖3所示，其中干擾物質(zhì)濃度均為2.5 nmol·L-1。從圖中可以看出，除了let 7b和let 7c之外，其他物質(zhì)對本實驗基本無干擾。干擾主要取決于干擾分子與目標(biāo)分子之間序列的差異，如果二者差異大，鎖式探針則不能與干擾分子雜交，進而阻礙了后續(xù)的成環(huán)反應(yīng)和滾環(huán)擴增，導(dǎo)致最終干擾較??； 相反，二者之間序列越接近，干擾則越大。本論文選取的六種干擾miRNA中，miR-21和miR-143與目標(biāo)分子差異最大，因此它們對let 7a的檢測幾乎無影響。其他四種干擾分子均來自let 7家族，彼此之間序列非常相近，僅相差1～4個堿基，盡管如此，let 7g和let 7i也幾乎不干擾let 7a的檢測，這是因為二者與let 7a的序列差異正好位于與鎖式探針雜交的缺口處，有效阻止了鎖式探針的成環(huán)反應(yīng)。但let 7b，let 7c與let 7a在探針雜交的缺口處完全相同，因此二者造成的干擾比較大。

圖2 (a)不同濃度let 7a的歸一化熒光發(fā)射光譜； (b)let 7a濃度與I520/I423值的關(guān)系圖(內(nèi)插圖： let 7a的標(biāo)準(zhǔn)曲線)

Fig.2(a)NormalizedfluorescenceemissionspectraoftheFRET-basedmethodtreatedwithdifferentconcentrationsoflet7a; (b)TherelationshipoftheI520/I423ratiosandthedifferentconcentrationoflet7a(Inside:Thecalibrationcurveoflet7awiththedifferentconcentration)

圖3 miRNA特異性分析

2.5 實際樣品檢測

為了評價方法在復(fù)雜樣品分析方面的潛力，利用該方案對總RNA樣品中的let 7a進行了含量檢測?？俁NA樣品是使用RNAiso for Small RNA試劑盒從Hela細(xì)胞中提取得到，并采用吸光光度法對其中總RNA含量進行初步定量。然后，選取五份該樣品，每份中總RNA含量為0.156 μg，其中四份分別加入5，10，15和20 fmol的標(biāo)準(zhǔn)let 7a作為加標(biāo)樣品，利用本方案對上述樣品進行檢測，最終得出0.156 μg總RNA樣品中l(wèi)et 7a含量為19.6 fmol，四個加標(biāo)樣品中l(wèi)et 7a的回收率分別為101.0%，90.7%，103.4%和100.9%，由此可知，本方法對加標(biāo)樣品測量的回收率基本令人滿意，說明該方法在復(fù)雜樣品分析中具有一定的應(yīng)用潛力。

3 結(jié) 論

利用SG對雙鏈DNA的染色作用及其與陽離子共軛聚合物之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，以滾環(huán)擴增技術(shù)作為信號放大手段，建立了一種新型的miRNA檢測方法。該方法具有兩個明顯的優(yōu)點： (1) 通過摻入SG的方式使?jié)L環(huán)擴增產(chǎn)物具有強烈的熒光，因此無需引入熒光標(biāo)記的特定DNA探針，在降低實驗成本和簡化實驗方案方面具有一定的優(yōu)勢。(2) 利用了以陽離子共軛聚合物作為供體的熒光共振能量轉(zhuǎn)移策略，陽離子共軛聚合物的熒光放大特性使檢測靈敏度得到了一定的提高。