張文月,郝文會,趙 靜,王愈聰*
1. 河北大學化學與環(huán)境科學學院,藥物化學與分子診斷省部共建教育部重點實驗室,河北 保定 071002 2. 河北大學綜合實驗中心,河北 保定 071002
MicroRNAs(miRNA)是一類非編碼小RNA,其長度約為20~24個核苷酸,可參與細胞內多種生命過程,并具有重要的調節(jié)作用[1]。目前已有研究證明,miRNA的表達與多種疾病尤其是癌癥密切相關[2],并且miRNA可以穩(wěn)定存在于生物體外周血循環(huán)過程中[3],因此通過血液中miRNA含量的檢測可以實現(xiàn)多種疾病的早期診斷和篩選。早期miRNA通常是通過Northern印跡雜交法[4]、微陣列芯片技術[5]及實時定量聚合酶鏈式反應法[6]等方法來檢測。雖然這些方法準確度比較高,但均存在一定的缺陷。由于miRNA序列短并且豐度低,人們發(fā)展了多種擴增技術對其進行信號放大,滾環(huán)擴增技術(RCA)就是其中一種。該技術由Jonstrup等[7]于2006年引入到miRNA檢測中,跟傳統(tǒng)方法相比,它不需要變溫熱循環(huán),在恒溫條件下即可達到與聚合酶鏈式反應相當?shù)撵`敏度,另外,miRNA的短序列正好與滾環(huán)擴增中掛鎖探針所需模板長度相匹配。因此,滾環(huán)擴增技術在miRNA檢測中受到了廣泛的關注。
陽離子共軛聚合物是由大量吸光單元共軛而成的高分子化合物,具有較強的光捕獲能力,常被用作熒光傳感探針以達到放大熒光信號的目的,進而實現(xiàn)目標分子的高靈敏度檢測[8-10]。陽離子共軛聚合物可以和帶負電的DNA通過靜電相互作用結合,如果對DNA進行適當?shù)臒晒鈽擞?,二者可以發(fā)生熒光共振能量轉移(FRET)現(xiàn)象[11],該現(xiàn)象目前已被廣泛應用到多種生物分子的檢測中[12]。
本文將滾環(huán)擴增技術高效的信號放大作用和陽離子共軛聚合物介導的FRET策略結合起來,發(fā)展了一種新型的miRNA檢測方案。該方法中,首先使用目標分子引發(fā)滾環(huán)擴增反應,其擴增產(chǎn)物與互補序列雜交形成長序列雙鏈DNA,然后以SYBR Green Ⅰ(SG)使該DNA染色并作為FRET能量受體,此時加入陽離子共軛聚合物作為能量供體,染色后的DNA與陽離子共軛聚合物通過靜電吸附作用結合誘發(fā)強烈的FRET效應。目標分子與體系的FRET效率直接相關,因此通過本方案可以進行miRNA的定量檢測。由于整個檢測過程中均不需要提前標記的探針參與,本策略在簡化方案和降低成本方面具有一定的優(yōu)勢。
(1)儀器: PCR(2720 Thermal Cycler,美國); Fluorolog 3-211 熒光光譜儀(Horiba Jobin-Yivon,法國); pH計(雷磁pH S-3C型,上海精密科學儀器有限公司)。
(2)試劑: T4 DNA連接酶、10×T4 buffer購于New England Biolabs,其中10×T4 buffer pH為7.5,包含MgCl2(100 mmol·L-1),ATP(10 mmol·L-1),Tris-HCl(500 mmol·L-1)及DTT(100 mmol·L-1); phi29 DNA聚合酶、10×phi29 buffer購于Thermo Fisher Scientific,其中10×phi29 buffer pH為7.9,包含Mg-acetate(100 mmol·L-1),Tris-acetate(330 mmol·L-1),DTT(10 mmol·L-1),Tween-20(1%)及K-acetate(660 mmol·L-1); dNTPs及RNA酶抑制劑購于寶生物科技有限公司(中國,大連); SYBR Green Ⅰ(20×,SG)購于廈門致善生物科技股份有限公司; 聚[(9,9-雙(6’-N,N,N-三乙基銨)己基)亞芴基亞苯基二溴化物](PFP)購于常州欣宏科生物化學有限公司; HEPES購于Sigma-Aldrich; DEPC水及試驗所用DNA均購于生工生物工程(上海)股份有限公司; 實驗中所用的miRNA均由寶生物科技有限公司(中國,大連)合成。DNA及miRNA序列如下所示: 鎖式探針,5’-P-CTACTACCTCATGGCATACAGGGAGCCAGGCATGGC-ATACAGGGAGCCAGGCAAACTATACAAC-3’; 互補鏈H1,5’-AACTATACAACCTACTACCTCA-3’; 互補鏈H2,5’-TGGCATACAGGGAGCCAGGCA-3’; Let-7a,5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’; Let-7b,5’-UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU-3’; Let-7c,5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU-3’; Let-7g,5’-UGAGGUAGUAGUUUGUACAGU-3’; Let-7i,5’-UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGU-3’; miR-21,5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’; miR-143,5’-UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC-3’。
(1) 鎖式探針成環(huán): 分別將20 U的T4 DNA連接酶、100 nmol·L-1的鎖式探針、1× T4 buffer,0.4 U RNA酶抑制劑與目標分子let 7a混合于10 μL體系中,然后利用PCR儀將該體系在37 ℃條件下反應2 h,此時鎖式探針的缺口被T4 DNA連接酶連接,鎖式探針成環(huán)狀。之后,升高溫度為65 ℃,恒溫10 min,使T4 DNA連接酶失活。
(2) 滾環(huán)擴增過程: 總反應體積為10 μL,包含2.5 μL上述反應液、0.25 mmol·L-1dNTPs,1× phi29 buffer,0.5 U phi29 DNA 聚合酶和5 μL DEPC水,首先在30 ℃下反應2 h,此時得到延伸產(chǎn)物長單鏈DNA。然后升高溫度為65 ℃,恒溫10 min,使phi29 DNA聚合酶失活。
(3) 延伸產(chǎn)物與互補鏈的雜交反應: 總反應體積為15 μL,包含上述反應體系和濃度均為10 nmol·L-1的H1和H2。首先將反應液升溫至95 ℃,使DNA變性3 min,然后調節(jié)溫度為30 ℃,恒溫30 min,使雜交反應進行完全。
(4) 熒光共振能量轉移過程: 總反應體積為100 μL,包含步驟3的反應液、0.4×SG染料和150 nmol·L-1PFP,利用熒光光譜儀測量該反應液的熒光光譜。
利用陽離子共軛聚合物與染料分子SG之間的FRET作用,以滾環(huán)擴增技術作為信號放大手段,本論文設計了一種新型的miRNA檢測方法,原理如圖1所示。首先將鎖式探針與目標分子let 7a特異性雜交,形成帶缺口的掛鎖結構,在T4 DNA連接酶的作用下,鎖式探針閉合呈環(huán)狀結構,之后在phi29 DNA聚合酶的作用下,該環(huán)狀鎖式探針從目標分子的3’端開始滾環(huán)擴增,得到一條長單鏈DNA產(chǎn)物。H1和H2為與該擴增產(chǎn)物互補的兩條DNA鏈,因此,當二者加入到反應體系中時,擴增產(chǎn)物將與H1和H2雜交形成長序列的雙鏈DNA。SG是一種熒光染料,單獨存在時熒光很弱,但與雙鏈DNA結合之后則具有強烈的熒光。PFP是一種陽離子共軛聚合物,可以與雙鏈DNA因靜電吸附作用而結合。因此,在上述溶液中加入SG和PFP之后,DNA-SG雜合體與PFP緊密結合,使SG和PFP之間距離很近,由于PFP的發(fā)射峰位置正好與SG的激發(fā)峰位置重疊,因此二者可產(chǎn)生FRET效應。如果體系中不存在目標分子,鎖式探針將不能成環(huán),后續(xù)的一系列反應都將無法進行,因此體系不能產(chǎn)生FRET現(xiàn)象。目標分子的濃度直接關系到擴增產(chǎn)物的含量,進而影響體系的FRET效率(I520/I423),因此通過記錄體系的I520/I423值可對目標分子進行定量檢測。
為了提高方法的分析檢測性能,本文對實驗條件進行了考察。
首先對鎖式探針、T4 DNA連接酶、phi29 DNA聚合酶及dNTPs的濃度進行了優(yōu)化。結果表明,隨著四種反應物濃度的增加,空白均未有明顯變化。而樣品的信號隨著四種反應物濃度的增加,均先增加,達到最大值后變化趨緩,根據(jù)優(yōu)化結果,選擇100 nmol·L-1鎖式探針、20 U T4 DNA 連接酶、0.5 U phi29 DNA聚合酶及125 μmol·L-1dNTPs作為后續(xù)實驗的最佳用量。
圖1 基于無標記的FRET策略檢測let 7a原理圖
然后對PFP的用量進行了優(yōu)化,結果表明,隨著PFP濃度的增加,空白的FRET效率(I520/I423)變化不大,樣品的I520/I423值呈先不變而后降低的趨勢,這是因為隨著PFP用量的增加,擴增雜交產(chǎn)物相對不足,造成沒有足夠的能量受體所致。最終選擇PFP的最佳用量為150 nmol·L-1。
利用最優(yōu)化的實驗條件,詳細考察和評價了本文提出的方法對不同濃度let 7a的分析性能,結果如圖2所示。本實驗中FRET效率利用520 nm處和423 nm處的熒光強度比值(I520/I423)來表示,圖中將熒光光譜圖在423 nm處進行了歸一化處理,因此通過譜圖中520 nm處的熒光強度即可反映出不同濃度的let 7a所引起的FRET效率的變化。從圖2(a)可以看出,目標分子濃度的增加可引起光譜圖中520 nm處熒光強度的持續(xù)增大,圖2(b)為目標分子濃度和I520/I423之間的關系圖,從其內插圖中可以看出let 7a檢測的線性范圍為0.05~5 nmol·L-1,線性方程為Δ(I520/I423)=0.14+0.10c(c/nmol·L-1,R=0.995 1)。
由于PFP具有光捕獲和光增強效應,通??商岣叻椒ǖ撵`敏度,為了驗證這一點,本文在無PFP參與的情況下,考察了只加入SG時系統(tǒng)的熒光強度隨著let 7a濃度的變化情況。結果表明,該方法所能檢測的最低let 7a濃度為0.2 nmol·L-1,而本文提出的FRET方案,最低let 7a檢測濃度為0.05 nmol·L-1,二者相差四倍,充分證明了PFP的加入確實達到了提高靈敏度的目的。
利用不同類型的miRNA分子作為干擾物質,對方法的特異性進行了考察,結果如圖3所示,其中干擾物質濃度均為2.5 nmol·L-1。從圖中可以看出,除了let 7b和let 7c之外,其他物質對本實驗基本無干擾。干擾主要取決于干擾分子與目標分子之間序列的差異,如果二者差異大,鎖式探針則不能與干擾分子雜交,進而阻礙了后續(xù)的成環(huán)反應和滾環(huán)擴增,導致最終干擾較??; 相反,二者之間序列越接近,干擾則越大。本論文選取的六種干擾miRNA中,miR-21和miR-143與目標分子差異最大,因此它們對let 7a的檢測幾乎無影響。其他四種干擾分子均來自let 7家族,彼此之間序列非常相近,僅相差1~4個堿基,盡管如此,let 7g和let 7i也幾乎不干擾let 7a的檢測,這是因為二者與let 7a的序列差異正好位于與鎖式探針雜交的缺口處,有效阻止了鎖式探針的成環(huán)反應。但let 7b,let 7c與let 7a在探針雜交的缺口處完全相同,因此二者造成的干擾比較大。
圖2 (a)不同濃度let 7a的歸一化熒光發(fā)射光譜; (b)let 7a濃度與I520/I423值的關系圖(內插圖: let 7a的標準曲線)
Fig.2(a)NormalizedfluorescenceemissionspectraoftheFRET-basedmethodtreatedwithdifferentconcentrationsoflet7a; (b)TherelationshipoftheI520/I423ratiosandthedifferentconcentrationoflet7a(Inside:Thecalibrationcurveoflet7awiththedifferentconcentration)
圖3 miRNA特異性分析
為了評價方法在復雜樣品分析方面的潛力,利用該方案對總RNA樣品中的let 7a進行了含量檢測。總RNA樣品是使用RNAiso for Small RNA試劑盒從Hela細胞中提取得到,并采用吸光光度法對其中總RNA含量進行初步定量。然后,選取五份該樣品,每份中總RNA含量為0.156 μg,其中四份分別加入5,10,15和20 fmol的標準let 7a作為加標樣品,利用本方案對上述樣品進行檢測,最終得出0.156 μg總RNA樣品中l(wèi)et 7a含量為19.6 fmol,四個加標樣品中l(wèi)et 7a的回收率分別為101.0%,90.7%,103.4%和100.9%,由此可知,本方法對加標樣品測量的回收率基本令人滿意,說明該方法在復雜樣品分析中具有一定的應用潛力。
利用SG對雙鏈DNA的染色作用及其與陽離子共軛聚合物之間的熒光共振能量轉移現(xiàn)象,以滾環(huán)擴增技術作為信號放大手段,建立了一種新型的miRNA檢測方法。該方法具有兩個明顯的優(yōu)點: (1) 通過摻入SG的方式使?jié)L環(huán)擴增產(chǎn)物具有強烈的熒光,因此無需引入熒光標記的特定DNA探針,在降低實驗成本和簡化實驗方案方面具有一定的優(yōu)勢。(2) 利用了以陽離子共軛聚合物作為供體的熒光共振能量轉移策略,陽離子共軛聚合物的熒光放大特性使檢測靈敏度得到了一定的提高。