包乙君 綜述 趙然尊 審校

遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，貴州 遵義 563000

近年來冠心病嚴(yán)重威脅了人類的健康，已成為世界各國死亡的主要原因之一。目前冠心病主要治療方案包括：改變生活方式、藥物干預(yù)和血管重建術(shù)。其中經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)是主要的血運(yùn)重建治療策略。但PCI術(shù)后支架內(nèi)再狹窄是影響遠(yuǎn)期療效的最重要并發(fā)癥之一。裸金屬支架(bare metal stent，BMS)的使用消除了部分有利于形成再狹窄的因素，將再狹窄發(fā)生率從50%降低到20%～30%[1]；藥物洗脫支架(drug eluting stent，DES)時(shí)代的到來將再狹窄率進(jìn)一步降低至10%以下[2]。目前，對(duì)于再狹窄機(jī)制尚未完全闡明，支架置入后新生內(nèi)膜形成和新生動(dòng)脈粥樣硬化形成是支架內(nèi)再狹窄最重要機(jī)制。近年來研究顯示，microRNAs可能通過多種途徑或機(jī)制參與新生內(nèi)膜形成、炎癥反應(yīng)以及新生動(dòng)脈粥樣硬化形成，進(jìn)而涉及再狹窄。本文通過文獻(xiàn)復(fù)習(xí)綜述了microRNAs 在冠脈支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生機(jī)制以及防治等方面的研究新進(jìn)展。

1 MicroRNAs概述

MicroRNAs (miRNAs)是一類內(nèi)源性、小的非編碼RNA，長度為19～25 個(gè)核苷酸，通過與靶信使RNA(miRNAs)的3'-非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控各種基因表達(dá)。1993 年第一個(gè)miRNA 即Lin-4 在秀麗隱桿線蟲中被發(fā)現(xiàn)[3]。2002 年發(fā)布了主要miRNAs 數(shù)據(jù)庫，包含來自五個(gè)物種的218 個(gè)microRNAs基因座，且總數(shù)仍持續(xù)增加[4]。最新的miRBase 序列數(shù)據(jù)庫包含38 589 個(gè)條目，來自271 個(gè)生物的發(fā)夾前體microRNAs，這些發(fā)夾前體產(chǎn)生總共48 860 個(gè)不同的成熟microRNAs序列[5]。已知MicroRNAs參與調(diào)節(jié)心臟的多種疾病包括：心血管系統(tǒng)的發(fā)育、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、心律失常、心力衰竭、心血管疾病介入治療再狹窄等[6]。

2 冠脈支架術(shù)后再狹窄的病理生理機(jī)制

冠脈支架術(shù)后再狹窄(in-stent restenosis，ISR)是指支架內(nèi)全程和或支架兩端5 mm 節(jié)段內(nèi)的管腔丟失，導(dǎo)致管腔狹窄程度≥50%。而臨床定義為需要靶病變或靶血管的血運(yùn)重建癥狀性的再狹窄，表現(xiàn)為心絞痛或急性心肌梗死等。根據(jù)Mehran 分類系統(tǒng)，可以將ISR分為四型：①Ⅰ型，即局灶型，可以細(xì)分為連接型、邊緣型、單一局灶型和多點(diǎn)局灶型；②Ⅱ型，即彌漫型；③Ⅲ型，即增殖型；④Ⅳ型，即閉塞型。因此了解ISR 的病理生理發(fā)生機(jī)制對(duì)ISR 的治療更有指導(dǎo)意義。既往在普通球囊(無支架)血管成形術(shù)(plain old balloon angioplasty，POBA)中，ISR 的機(jī)制主要包括：血管重構(gòu)和彈性反沖。而支架內(nèi)血管成形術(shù)后的再狹窄涉及內(nèi)皮損傷、內(nèi)皮功能失調(diào)及新生內(nèi)膜增殖和新動(dòng)脈粥樣硬化形成，其中新動(dòng)脈粥樣硬化的形成過程與內(nèi)皮細(xì)胞的不完全再生有關(guān)，導(dǎo)致一系列的急性或慢性炎癥反應(yīng)，新生脂質(zhì)的攝入過多以及新生內(nèi)膜中動(dòng)脈粥樣硬化斑塊加速發(fā)展[7]。由此，導(dǎo)致ISR 的三個(gè)主要過程是：彈性反沖、內(nèi)膜增殖和新動(dòng)脈粥樣硬化形成。其中最重要的是內(nèi)膜增殖，這主要是內(nèi)皮損傷引發(fā)炎癥反應(yīng)，并且在介質(zhì)中擴(kuò)散變化，導(dǎo)致血小板、纖維蛋白的沉積以及巨噬細(xì)胞的黏附進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)膜增生；還有另一種現(xiàn)象主要是由于血管平滑肌的增殖及其隨后的消融遷移，導(dǎo)致管腔變窄。許多研究發(fā)現(xiàn)microRNAs 是參與上述過程的重要調(diào)節(jié)因子[8]。

3 MicroRNAs調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞參與再狹窄

一個(gè)正常的內(nèi)皮系統(tǒng)非常重要，因?yàn)樗鼌⑴c了血管張力的調(diào)節(jié)，并通過抑制炎癥、血栓形成及血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移來抑制內(nèi)膜增生。支架植入術(shù)后引起內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell，EC)的機(jī)械性損傷，導(dǎo)致一系列炎癥反應(yīng)、血栓形成等，從而引起支架內(nèi)再狹窄的形成。因此維持內(nèi)皮細(xì)胞完整性及其正常功能對(duì)ISR的形成具有抑制作用。在血管內(nèi)皮細(xì)胞中miRNA表達(dá)最高的是miR-126，它參與血管內(nèi)皮功能障礙和血管發(fā)育的調(diào)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn)miR-126 是血管完整性的主要調(diào)節(jié)因子。它由血管內(nèi)皮抑制素(VE-statin)基因的內(nèi)含子7編碼，也被稱為EGF樣結(jié)構(gòu)域7 (EGFL7)，由E-26家族轉(zhuǎn)錄因子ETS1/2控制。在斑馬魚中敲低miR-126 會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育過程中血管完整性喪失和出血，miR-126 的功能部分是通過直接抑制VEGF 通路的負(fù)調(diào)節(jié)劑，包括Sprouty 相關(guān)蛋白、SPRED1 和磷酸肌醇3 激酶調(diào)節(jié)亞基2 (PIK3R2)產(chǎn)生的[9-10]。miR-221/222 族參與維持內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和支持內(nèi)皮細(xì)胞靜態(tài)表型。例如，將人肝竇形內(nèi)皮細(xì)胞暴露于臨床劑量的電離輻射會(huì)導(dǎo)致AMP 激活蛋白激酶(AMPK)和p38絲裂原激活，AMPK和p38 MAPK途徑均通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶2 (MMP-2)和血管內(nèi)皮生長因子受體2 (VEGFR-2)來促進(jìn)輻射誘導(dǎo)的人肝竇形內(nèi)皮細(xì)胞血管生成行為[11]。有研究觀察到輻射照過的人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞可誘導(dǎo)血管生成相關(guān)的miRNA 表達(dá)，包括miR-221/222 簇，它本身不支持新血管生成，但有助于維持已組裝的新血管內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)定性和完整性[12]。實(shí)際上，在EC中，miR-221/222簇顯示出抗血管生成活性，并阻止了內(nèi)皮向血管重塑和新血管形成的激活。miR-221/222 負(fù)責(zé)建立EC 的靜態(tài)表型并維持血管內(nèi)皮的穩(wěn)態(tài)。

內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)在內(nèi)皮功能的調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用，并通過產(chǎn)生一氧化氮(NO)來充當(dāng)血管張力和體內(nèi)平衡的主要調(diào)節(jié)劑。NO的產(chǎn)生對(duì)于促進(jìn)內(nèi)皮完整性和內(nèi)皮再生至關(guān)重要，最近已報(bào)道鳥苷三磷酸環(huán)水解酶1 (GCH1)是miR-133a 的靶標(biāo)。GCH1 缺乏對(duì)于內(nèi)皮功能障礙中eNOS 解偶聯(lián)至關(guān)重要。miR-133a在內(nèi)皮細(xì)胞中的異位表達(dá)參與了許多種心血管疾病(CVD)危險(xiǎn)因素誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙。有趣的是，他汀類藥物通過抑制異常的miR-133a 表達(dá)來預(yù)防內(nèi)皮功能障礙，從而上調(diào)GCH1 基因表達(dá)[13]。此外，miR-199a-3p 與miR-199a-5p[14]、miR-155[15]、miR-21[16]也參與NO 失調(diào)的內(nèi)皮功能障礙。關(guān)于支架植入后受損冠狀動(dòng)脈的再內(nèi)皮化這樣的結(jié)構(gòu)提供了一個(gè)非生理表面黏合，并產(chǎn)生了較高的剪切引力，而高剪切應(yīng)力則損害EC 功能[17]。最新的研究表明miR-93 和miR-484 受剪切引力的調(diào)節(jié)參與內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[18]。

4 MicroRNAs調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)參與再狹窄

支架植入術(shù)后引起內(nèi)皮損傷，促使一系列炎癥反應(yīng)。炎癥反應(yīng)參與冠脈支架術(shù)后再狹窄各個(gè)階段，對(duì)平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換、增殖及遷移，動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展及新生動(dòng)脈粥樣硬化的形成等都尤為重要。EC的損傷使EC活化，激活EC后，它們會(huì)表達(dá)單核細(xì)胞趨化蛋白1、白介素(IL)-8、細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)、血管黏附分子1 (VCAM-1)、E選擇素、P選擇素和其他炎性因子，吸引淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞與內(nèi)皮結(jié)合并浸潤到動(dòng)脈壁中，炎癥由此便開始發(fā)生[19]。此過程涉及許多細(xì)胞和細(xì)胞因子的參與[20]，ZHU 等[21]發(fā)現(xiàn)miR-155和miR-221/222通過靶向血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)中的血管緊張素Ⅱ型受體(AT1R)或轉(zhuǎn)錄因子Ets-1參與內(nèi)皮炎癥和EC 遷移。YANG 等[22]證實(shí)了Smad3 是miR-216a的潛在靶標(biāo)基因，miR-216a抑制Smad3蛋白表達(dá)并介導(dǎo)下游IκBα降解，從而激活了內(nèi)皮細(xì)胞中N-κB響應(yīng)黏附分子(如ICAM1 和VCAM1)，從而促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)單核細(xì)胞的黏附能力，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮炎癥。ZHENG 等[23]證明了miR-24 的過表達(dá)顯著抑制importin-α3(KPNA4)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，并負(fù)調(diào)控內(nèi)皮炎性因子TNF-α的表達(dá)。miR-24 通過阻斷NF-κB信號(hào)通路、調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥以及抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移而發(fā)揮其在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用。SU 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，miR-181a-5p 和miR-181a-3p通過分別靶向TAB2 和NEMO 來阻斷NF-κB 激活和血管炎癥，從而延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，進(jìn)而抑制血管炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化。

內(nèi)皮的損傷到炎癥的激活，再到單核細(xì)胞成為組織巨噬細(xì)胞并內(nèi)化脂蛋白顆粒并產(chǎn)生泡沫細(xì)胞(新生動(dòng)脈粥樣硬化的標(biāo)志)，泡沫細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子、活性氧和其他介質(zhì)；巨噬細(xì)胞會(huì)死亡，包括通過凋亡而死亡，形成成熟斑塊的脂質(zhì)或“壞死”核心；巨噬細(xì)胞的作用放大了局部炎癥反應(yīng)。YANG 等[25]證明了miR-155 在oxLDL 刺激的巨噬細(xì)胞中促進(jìn)炎癥和巨噬細(xì)胞遷移增強(qiáng)了STAT3和NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化炎癥。CEOLOTTO 等[26]通過對(duì)有和沒有動(dòng)脈粥樣硬化的患者的血漿樣本中篩選了一組179種分泌的microRNA，并在隨訪至11 年的患者中進(jìn)行了橫斷面和前瞻性驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)miR-30c-5p通過清除劑受體CD36 被氧化的LDL (oxLDL)下調(diào)，并通過Dicer 抑制miR加工。反過來，miR-30c-5p的下調(diào)負(fù)責(zé)oxLDL對(duì)巨噬細(xì)胞IL-1β釋放，Caspase-3 表達(dá)和凋亡的影響，并確定了miR-30c-5p在微粒中的減少是早期動(dòng)脈粥樣硬化的啟動(dòng)子，它通過傳遞促炎性促凋亡信號(hào)和損害內(nèi)皮細(xì)胞的愈合來實(shí)現(xiàn)。

5 MicroRNAs調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞參與再狹窄

在生理?xiàng)l件下，血管平滑肌是一種高度特化的幾乎靜止的細(xì)胞群，其主要功能是維持血管張力，確保血管的收縮。它們在成熟血管中呈現(xiàn)分化狀態(tài)，增殖率較低(≈5%)，表達(dá)一組特殊的收縮蛋白(如平滑肌肌球蛋白重鏈、平滑肌肌動(dòng)蛋白、Calponin等)。然而，血管平滑肌細(xì)胞具有顯著的可塑性，可以很容易地進(jìn)行表型轉(zhuǎn)換，在炎癥反應(yīng)和各種炎癥介質(zhì)(包括細(xì)胞生長因子和趨化因子等)的刺激下，從高度專一化的收縮狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣苫蛟鲋碃顟B(tài)，隨后增殖和遷移速度增加，收縮蛋白的表達(dá)水平降低[8]。血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換、增殖及遷移參與再狹窄，在這種情況下許多microRNAs 參與血管平滑肌的調(diào)控。眾所周知，miR-143和miR-145被認(rèn)為是血管發(fā)育過程中和血管疾病中血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的主要調(diào)節(jié)因子[27]，其表達(dá)模式與α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(ACTA2)、平滑肌肌球蛋白重鏈和calponin 表達(dá)所定義的分化表型相關(guān)[12]。miR-125a-5p 在血管平滑肌細(xì)胞中高表達(dá)，但在血管損傷后表達(dá)下調(diào)。它的過度表達(dá)足以減少血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，并能促進(jìn)選擇性血管平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(ACTA2)、肌球蛋白重鏈11 (MYH11) 和 平 滑 肌22 α (SM22 α) 的 表 達(dá)。miR-125a-5p直接靶向ETS-1是一種參與細(xì)胞增殖和遷移的轉(zhuǎn)錄因子，在血管平滑肌細(xì)胞PDGF-BB 途徑中起關(guān)鍵作用。miR-125a-5p可抑制PDGF-BB通路，因此其是VSMCs 表型開關(guān)的潛在調(diào)節(jié)因子[28]。miR-21 也參與血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)，HUANG 等[29]的實(shí)驗(yàn)證明了miR-21 不僅在促進(jìn)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMCs)的α-肌動(dòng)蛋白中起重要作用，而且還通過AKT 和ERK 信號(hào)通路改變了人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMCs)的細(xì)胞形狀，進(jìn)一步證明了miR-21是調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的重要調(diào)節(jié)因子。

在血管再狹窄中miR-221 和miR-222 兩種miRNAs均能促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖。是通過抑制靶基因p27 (Kip1)和p57 (Kip2)來實(shí)現(xiàn)的，miR-221 和miR-222的基因敲除減弱了血管成形術(shù)后大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜增生[30]。最近的一份報(bào)告還報(bào)道了糖尿病小鼠血管平滑肌細(xì)胞和動(dòng)脈中miR-221和miR-222水平的升高。有趣的是，抑制這兩種miRNAs可防止糖尿病動(dòng)脈損傷引起的血管平滑肌細(xì)胞異常增殖[31]。FENG等[32]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)頸動(dòng)脈損傷后的大鼠血管平滑肌細(xì)胞中miR-93 上 調(diào)。miR-93 是通過Raf-ERK1/2 途徑介 導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的發(fā)生。 此外，TORELLA等[33]的實(shí)驗(yàn)表明，miR-133在體外和體內(nèi)均在血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)中穩(wěn)定表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-133參與了血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的調(diào)控。腺病毒介導(dǎo)的miR-133 的過度表達(dá)可以減弱球囊損傷后的內(nèi)膜形成，而抑制其內(nèi)源性水平則會(huì)產(chǎn)生相反的作用。值得注意的是，miR-133通過靶向轉(zhuǎn)錄因子Sp-1和Moesin 減少了血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移[34]。SUN等[35]研究發(fā)現(xiàn)miR-206在損傷血管壁增殖性血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)明顯增加，miR-206 通過靶向ZFP580 參與血管成形術(shù)后血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換和新生內(nèi)膜病變的形成。 通過慢病毒介導(dǎo)的miR-206 減少了球囊損傷后新生內(nèi)膜的形成，這些發(fā)現(xiàn)可能為血管成形術(shù)后再狹窄提供新的治療靶點(diǎn)。miR-181b通過激活PI3K和MAPK信號(hào)通路促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。根據(jù)這一結(jié)果，抑制內(nèi)源性miR-181b 可抑制大鼠頸動(dòng)脈成形術(shù)后新生內(nèi)膜增生[36]。據(jù)報(bào)道，miR-663通過負(fù)調(diào)控JUNB和肌球蛋白輕鏈9 (MLC9)靶向作用于人血管平滑肌細(xì)胞的遷移和分化標(biāo)志基因。此外，miR-663 在體內(nèi)的過表達(dá)減少了小鼠頸動(dòng)脈結(jié)扎所致血管損傷后新生內(nèi)膜損傷的形成[37]。miRNAs介導(dǎo)的抑制平滑肌細(xì)胞增生和新內(nèi)膜形成的例子還包括miR-9[38]和miR-599[39]。

6 MicroRNAs涉及新生動(dòng)脈粥樣硬化

支架內(nèi)新生動(dòng)脈粥樣硬化(in-stentneoatherosclerosis，ISNA)的形成過程與內(nèi)皮細(xì)胞的不完全再生有關(guān)，導(dǎo)致一系列的急性或慢性炎癥反應(yīng)、新生脂質(zhì)的攝入過多以及新生內(nèi)膜中動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的加速發(fā)展[7]。ISNA 的形成這個(gè)概念最早在2010 年被提出。關(guān)于microRNA 與新生動(dòng)脈粥樣硬化之間的關(guān)系，可能與microRNA調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的完整性、炎癥反應(yīng)等有關(guān)，如上所述，但目前尚未明確提出關(guān)于調(diào)節(jié)ISNA有關(guān)的microRNA。

7 總結(jié)

針對(duì)心血管疾病介入治療再狹窄的問題，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為該過程是多因素共同導(dǎo)致的，包括：炎癥因子的激活、內(nèi)皮細(xì)胞的不全再生、平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移、新動(dòng)脈粥樣硬化的形成等。目前有多種治療方法可用于治療冠脈支架內(nèi)再狹窄，而且治療通常涉及不止一種技術(shù)，包括：藥物治療、舊球囊血管成形術(shù)(POBA)、血管近距離放射療法(VBT)、切割球囊等。然而心血管介入治療再狹窄的問題，仍然是目前的熱點(diǎn)問題，需要提出新的針對(duì)支架內(nèi)再狹窄的解決手段。MicroRNAs 被發(fā)現(xiàn)參與心血管介入治療再狹窄的多種調(diào)節(jié)，因此基因洗脫支架的新發(fā)展是支架技術(shù)的重大突破。這種支架不僅可以提供抗炎和抗血栓藥物，還可以攜帶miRNA和siRNA等ncRNA。此外，目前對(duì)心血管疾病介入治療再狹窄的認(rèn)識(shí)還很有限。因此，盡管ncRNA在動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)中顯示出潛在的益處，但心血管疾病患者的ncRNA支架植入仍有很長的路要走。