曾涵芳，李燁青，王澤棟，張林，朱靖，謝穎，韓兆玉

（南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院乳牛科學研究所，南京 210095）

全球性氣候變暖的大環(huán)境限制了我國奶牛業(yè)發(fā)展，尤其是華東、華南地區(qū)的夏季高溫高濕環(huán)境條件，使奶牛長期處于熱應(yīng)激狀態(tài)，最終導(dǎo)致采食量下降、乳品質(zhì)降低、繁殖性能下降、乳房炎發(fā)病率升高，使牛奶價格持續(xù)走低，給奶牛行業(yè)帶來極大的經(jīng)濟損失[1,2]。中草藥大部分提取于純天然綠色植物，含有多種生物活性物質(zhì)，因其易得、作用廣泛，同時具有營養(yǎng)和藥用價值而日益受到養(yǎng)殖業(yè)者們的青睞[3]。大量研究表明，中草藥的添加對畜禽的生長性能、免疫反應(yīng)和血清代謝指標等有顯著影響，因此是抗生素飼料添加劑的潛在替代品[4,5]。黃芪多糖（APS）是中藥黃芪中的主要活性成分，目前它的應(yīng)用主要集中在免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎和抗癌作用方面[6]。研究表明，在肉雞日糧中添加APS能夠減輕環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制[7]。徐盛明等[8]在斷奶仔豬日糧中添加一定量的APS結(jié)果改善了斷奶仔豬生產(chǎn)性能以及抗氧化能力。此外，在肉雞慢性熱應(yīng)激模型研究中發(fā)現(xiàn)，添加有黃芪成分的復(fù)方中藥，其機體的抗氧化能力顯著提升，可清除熱應(yīng)激誘導(dǎo)生成的氧化自由基[9]。但是，關(guān)于APS在熱應(yīng)激奶牛中的應(yīng)用研究卻鮮有報道。因此，本試驗擬對熱應(yīng)激奶牛注射APS，探究其對奶牛生產(chǎn)性能、血清代謝指標的影響，為APS對熱應(yīng)激下奶牛的應(yīng)用提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃芪多糖注射液（河北遠征藥業(yè)有限公司）；試驗?zāi)膛＃▉碜越K省淮安杰隆牧業(yè)奶牛場）。試驗牛泌乳期日糧營養(yǎng)水平參照江蘇省淮安杰隆牧業(yè)飼養(yǎng)標準，日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 奶牛日糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)水平）

1.2 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

試驗采用配對設(shè)計，根據(jù)胎次（1.95±0.95）、泌乳天數(shù)（220.34±42.73d）和泌乳量（34.45±4.89kg/d），選取30頭健康的中國荷斯坦牛，隨機分為對照組和試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組，每組10頭，在相同的條件下飼養(yǎng)。試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組奶牛分別于頸部肌肉注射APS注射液30mL/d、50mL/d。試驗于2018年7～8月份進行，分為三個階段，每個階段連續(xù)注射4d（每天早晨8點注射），停止3d，試驗期共21d。試驗?zāi)膛２捎盟ㄏ凳斤曫B(yǎng)，每天飼喂三次，自由飲水。

1.3 樣品的采集與測定

1.3.1 試驗牛舍溫濕指數(shù)的測定

試驗期間每天測定牛舍的溫度和濕度。溫濕指數(shù)（THI）的測定方法：每天8:00、14:00和20:00分別讀取牛舍內(nèi)前、中、后六個固定帶點的電子溫濕表溫度（T，℃）和相對濕度（RH，%），并計算THI，THI＝(1.8×T+32)- (0.55-0.55×RH)×(1.8×T-26)。

1.3.2 直腸溫度和呼吸頻率的測定

在試驗第0、4、7、11、14、18、21天測定試驗?zāi)膛５闹蹦c溫度和呼吸頻率，分別用獸用體溫計和秒表進行測定。

1.3.3 生產(chǎn)性能的測定

試驗期間，采用管道式擠奶器擠奶，每頭奶牛在試驗第0、4、7、11、14、18、21天測定產(chǎn)奶量，采奶樣使用全自動乳成分分析儀分析乳品質(zhì)，測定指標有乳脂、乳蛋白、乳糖、總固形物、體細胞數(shù)和乳尿素氮濃度。

1.3.4 血清生化指標的測定

在試驗第0、4、7、11、14、18、21天分別尾靜脈采血10mL，分離血清，-80℃保存待測。測定血清生化指標包括：總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）、葡萄糖（GLU）、游離脂肪酸（NEFA）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、β-羥丁酸（β-HBA）。試劑盒來源：南京建成生物工程研究所。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)由 Excel整理后，用SPSS 20.0的一般線性模型（GLM）進行雙因素方差分析（Twoway ANOVA），然后各組間進行最小顯著差數(shù)法（LSD）多重比較，所有數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標準誤（Mean±SEM）表示。為說明劑量效應(yīng)，整個試驗階段采用單因素分析（One-way ANOVA）。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗牛舍的環(huán)境溫濕指數(shù)

據(jù)相關(guān)研究資料，當牛舍環(huán)境THI低于72時，奶牛不會出現(xiàn)熱應(yīng)激；當THI在72～78之間時，會出現(xiàn)輕微熱應(yīng)激；當THI在78～88之間時，會出現(xiàn)中度熱應(yīng)激；當THI在89～98之間時，出現(xiàn)極嚴重熱應(yīng)激；當THI大于98時，奶牛將會死亡。由表2可知，試驗期間，牛舍的日平均溫度為34.14℃，相對濕度為63.53%，THI值為86.33，表明此環(huán)境下奶牛處于中度熱應(yīng)激狀態(tài)。

表2 牛舍環(huán)境的溫濕指數(shù)

2.2 黃芪多糖對熱應(yīng)激下奶牛直腸溫度及呼吸頻率的影響

圖1 黃芪多糖對熱應(yīng)激下奶牛直腸溫度的影響

如圖1所示，注射APS在時間和濃度上對奶牛直腸溫度沒有互作效應(yīng)（P＞0.05）；隨著時間的推移，三個組奶牛的直腸溫度均顯著增加（P＜0.05）。但在第4天時，試驗Ⅰ組奶牛的直腸溫度顯著比對照組低（P＜0.05）；在第11、18天時，試驗Ⅱ組奶牛的直腸溫度顯著比對照組低（P＜0.05）；在第14、21天時，試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組奶牛的直腸溫度均顯著比對照組低（P＜0.05）。此外，如圖2所示，注射APS在時間和濃度上對奶牛呼吸頻率沒有互作效應(yīng)（P＞0.05）；隨著時間的推移，三組奶牛呼吸頻率顯著上升（P＜0.05）。但在第4天時，試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組奶牛的呼吸頻率顯著比對照組低，且在第14天時，試驗Ⅱ組奶牛的呼吸頻率顯著比對照組低（P＜0.05）。試驗結(jié)果表明，在熱應(yīng)激條件下，隨著時間變化，奶牛的熱應(yīng)激加重，從而導(dǎo)致其直腸溫度和呼吸頻率上升，而注射APS后，能夠緩解其熱應(yīng)激。

圖2 黃芪多糖對熱應(yīng)激下奶牛呼吸頻率的影響

2.3 黃芪多糖對熱應(yīng)激下奶牛產(chǎn)奶量及乳品質(zhì)的影響

如表3所示，注射黃芪多糖在時間和濃度上對奶牛產(chǎn)奶量和乳成分沒有互作效應(yīng)（P＞0.05）；隨時間推移，三組奶牛的產(chǎn)奶量和4%標準乳均顯著降低（P＜0.05）；此外，在第7、14天時，試驗Ⅱ組4%標準乳顯著低于試驗Ⅰ組（P＜0.05）。另外，注射APS在時間和濃度上對奶牛的乳糖率、乳脂率、乳蛋白率、乳總固體率、乳尿素氮和乳體細胞數(shù)均沒有互作效應(yīng)（P＞0.05）；但隨時間推移，三組奶牛的乳糖率和尿素氮在第14天時均顯著降低（P＜0.05）。在第7、14、18天時，試驗Ⅰ組乳脂率顯著高于試驗Ⅱ組（P＜0.05），其他指標無差異（P＞0.05）。在第4、18、21天時，試驗Ⅰ組乳蛋白率顯著高于試驗Ⅱ組（P＜0.05），其他指標差異不顯著（P＞0.05）。在第7、11、18天時，試驗Ⅱ組的乳總固體率顯著比試驗Ⅰ組低（P＜0.05）。在第4、18天時，試驗Ⅱ組的尿素氮顯著比對照組低（P＜0.05），與試驗Ⅰ組無顯著差異（P＞0.05）。體細胞數(shù)在第14天時，試驗Ⅱ組顯著比試驗Ⅰ組高（P＜0.05）；在第18、21天時，試驗Ⅱ組體細胞數(shù)顯著低于對照組（P＜0.05）。另外，整個試驗階段注射APS對奶牛產(chǎn)奶量無顯著影響，4%標準乳試驗Ⅰ組顯著高于試驗Ⅱ組（P＜0.05）；試驗Ⅰ組乳蛋白率顯著高于對照組（P＜0.05）；總固形物試驗Ⅱ組顯著低于試驗Ⅰ組（P＜0.05）；尿素氮和體細胞數(shù)試驗Ⅱ組顯著低于對照組（P＜0.05）。因此，注射APS能提高4%標準乳、乳蛋白率，降低奶牛乳體細胞數(shù)，具有改善奶牛乳品質(zhì)的潛力。

表3 黃芪多糖對氧化應(yīng)激下奶牛產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)的影響

2.4 黃芪多糖對熱應(yīng)激下奶牛血清生化指標的影響

如表4所示，注射APS對氧化應(yīng)激下奶牛血清生化指標在時間和濃度上沒有互作效應(yīng)（P＞0.05）。在第4天時，試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組的β-HBA顯著低于對照組（P＜0.05），另外，整個試驗階段注射APS后，試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組奶牛血清β-HBA顯著低于對照組（P＜0.05）；其他指標無顯著差異（P＞0.05）。可以看出，APS可顯著減低氧化應(yīng)激下奶牛的血清β-HBA含量，對奶牛機體代謝不產(chǎn)生毒副作用。

2.5 黃芪多糖對熱應(yīng)激下奶牛血清蛋白的影響

如圖3所示，注射APS對奶牛血清蛋白在時間和濃度上沒有互作效應(yīng)（P＞0.05）。隨時間推移，在第18天時，試驗Ⅱ組總蛋白顯著高于其他兩組（P＞0.05）；且試驗Ⅰ組總蛋白在第4、11天時顯著升高（P＜0.05）。如圖4所示，隨時間推移，在第11天時，試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組的白蛋白顯著低于對照組（P＜0.05）。另外，如圖5所示，隨時間推移，在第11、14、18、21天時，試驗Ⅱ組的球蛋白顯著低于對照組（P＜0.05），與試驗Ⅰ組無顯著差異。因此，注射APS顯著降低了奶牛血清球蛋白（P＜0.05）。

表4 黃芪多糖對應(yīng)激下奶牛血清生化指標的影響

圖3 黃芪多糖對熱應(yīng)激下奶牛血清總蛋白的影響

圖4 黃芪多糖對熱應(yīng)激下奶牛血清白蛋白的影響

圖5 黃芪多糖對熱應(yīng)激下奶牛血清球蛋白的影響

3 討論

溫濕指數(shù)（THI）被常用于描述奶牛的熱應(yīng)激狀態(tài)。有研究認為當機體處于炎熱環(huán)境時，THI大于70可作為熱應(yīng)激的閾值[10]；但有研究表示在處于溫和環(huán)境時，THI超過60就已達到熱應(yīng)激水平[11]。此外，也有研究表明，當牛舍溫度高于25℃或者THI＞72時，就可引起奶牛的熱應(yīng)激[12]。本試驗于7～8月份在江蘇淮安進行，根據(jù)測量結(jié)果表明，牛舍的日平均溫度高達34.14℃，其平均相對濕度為63.53%，牛舍THI值達到86.33，奶牛處于中度熱應(yīng)激狀態(tài)。另一方面，在正常狀態(tài)下，奶牛的直腸溫度為38.5℃，當直腸溫度高于39℃并可排除疾病的可能時，奶牛就處于熱應(yīng)激狀態(tài)。當環(huán)境溫度升高時，除了以利用皮膚散熱之外，奶牛也同時通過增加呼吸頻率來增加散熱[13]。研究表明，在熱應(yīng)激期間飼喂中草藥，能顯著降低試驗各階段奶牛直腸溫度和呼吸頻率[14]。但陳以意等[15]研究表明，應(yīng)用中草藥添加劑能夠使奶牛直腸溫度和呼吸頻率下降，但沒有顯著差異。本研究結(jié)果顯示，試驗期間奶牛直腸溫度均在38.5℃以上，而且呼吸頻率異常，在60次/min以上，且隨時間推移，三組試驗?zāi)膛Ｖ蹦c溫度和呼吸頻率均顯著上升。但注射APS后，在短時間內(nèi)就能顯著降低直腸溫度和呼吸頻率，因此，APS能夠緩解熱應(yīng)激導(dǎo)致的奶牛直腸溫度和呼吸頻率的上升。

產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)作為衡量奶牛生產(chǎn)價值最直接的指標受高溫的影響非常顯著。研究表明，熱應(yīng)激能顯著降低奶牛的產(chǎn)奶量，并對乳蛋白和乳脂產(chǎn)生顯著影響，其主要原因是奶牛機體代謝異常導(dǎo)致采食量下降而引起的[16,17]。因此，研究者們通過改變?nèi)占Z能量組成[18]或添加過瘤胃保護性物質(zhì)[19]來提高奶牛的生產(chǎn)性能。據(jù)報道，柴胡添加劑對熱應(yīng)激奶牛的乳品質(zhì)沒有顯著影響，但是0.25和0.5g/kg的添加量可顯著提高乳脂和乳蛋白，因此，具有緩解奶牛熱應(yīng)激并提高其泌乳性能的功效[20]。此外，在娟姍牛日糧中添加益生菌與中草藥復(fù)合添加劑，可顯著增加產(chǎn)奶量及乳脂和非脂固形物含量[21]。然而，也有研究顯示，中藥處理前后奶牛的產(chǎn)奶量沒有顯著變化，但草藥產(chǎn)品的功效與常規(guī)藥品的療法相似，并且沒有明顯的副作用[22]。本研究結(jié)果顯示，試驗前后奶牛的產(chǎn)奶量和4%標準乳顯著下降，試驗組奶牛產(chǎn)奶量和4%標準乳與對照組相比無顯著變化趨勢，這可能與奶牛干物質(zhì)采食量有關(guān)。此外，本結(jié)果表明，注射APS能夠提高奶牛的乳蛋白率和乳脂率，并且降低體細胞數(shù)。這與李占鋒等[23]在奶牛日糧中添加黃芪組方中草藥的研究結(jié)果部分一致，其研究表明，在一定時間內(nèi)黃芪組方中草藥可提高奶牛產(chǎn)奶量，其他無顯著影響。另一方面，乳體細胞數(shù)是判斷奶牛機體是否處于健康狀態(tài)和乳品質(zhì)量的重要因素。研究表明，傳統(tǒng)中藥可降低奶牛乳體細胞數(shù)和淋巴細胞的凋亡率，從而提高奶牛的免疫功能[24]。本試驗結(jié)果表明，注射APS可降低體細胞數(shù)，這與王曉芳等[25]在熱應(yīng)激奶牛日糧中添加微量中藥發(fā)酵制劑降低體細胞數(shù)的研究結(jié)果一致。因此，APS可以對奶牛乳品質(zhì)產(chǎn)生影響，而且沒有毒副作用。

血清TP是ALB和GLB的總和，是機體蛋白質(zhì)代謝的重要指標。其中，ALB是機體蛋白的重要來源，同時也參與維持血液滲透壓、脂肪酸運輸?shù)?；GLB則與機體免疫密切相關(guān)。研究表明，中藥復(fù)方（含有石膏、黃柏、藿香、甘草等）能提高錦江黃牛血清中的TP、GLB含量，促進機體蛋白質(zhì)合成，增強機體免疫力[26]。Song等[27]在肉牛的研究中發(fā)現(xiàn)，中草藥的添加顯著增加了熱應(yīng)激下肉牛血清中TP、ALB和GLB的含量，并且其血糖呈先增后降的趨勢，緩解了肉牛的熱應(yīng)激。但是，本試驗研究結(jié)果表明，注射APS顯著降低了血清GLB含量，對TP和ALB沒有顯著影響。而Al-Saiadya等[28]在日糧中添加抗熱劑，得出與本試驗相似的結(jié)果，其試驗結(jié)果表明抗熱劑顯著降低奶牛血清TP、GLB的含量，提高ALB/GLB的比值。因此，APS有提高夏季奶牛免疫功能的潛力，這也可能是日糧組成、采食量不同以及牛生理差異等共同作用的結(jié)果。

日糧被瘤胃微生物有效降解所得的揮發(fā)性脂肪酸只能滿足奶牛70%～80%能量需求，奶牛主要通過糖異生來獲取葡萄糖。在泌乳高峰期，高產(chǎn)奶牛的能量需求超過了采食凈能，奶牛缺乏足夠的能量去維持產(chǎn)奶，熱應(yīng)激則更容易加重機體能量負平衡；因此，脂肪動員成為機體獲取能量而緩解能量負平衡的重要途徑[29]。脂肪氧化分解得到的NEFA被釋放進入血液，通過肝臟吸收和代謝形成TG、膽固醇和酮體等，是脂代謝的重要指標。本試驗結(jié)果顯示，注射APS后奶牛血清GLU、NEFA、TG、TC沒有顯著變化，但β-HBA在第4天時顯著降低。β-HBA在酮體中的含量最多，其在血清中含量的高低常被用于判斷奶牛是否患有酮病。本試驗APS的注射可能通過降低脂肪動員，從而減少β-HBA的生成，使機體能量負平衡有所改善，緩解了奶牛的熱應(yīng)激。這與Cheng等[30]的研究有相似結(jié)果，該研究應(yīng)用柴胡提取物后對熱應(yīng)激奶牛血清GLU、NEFA、TG沒有顯著影響，但機體總抗氧化能力和免疫功能有所增強。

綜上所述，APS能夠降低熱應(yīng)激下奶牛的直腸溫度、呼吸頻率、乳體細胞數(shù)及血清球蛋白，對熱應(yīng)激下奶牛的生理狀況和血清生化指標產(chǎn)生一定的影響，具有緩解奶牛熱應(yīng)激的潛力。