呂亞南，趙儉，姚競杰，安志興，郭利亞，張曉建

（河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003）

乳腺炎是泌乳牛乳房容易發(fā)生的一種持續(xù)性炎癥性疾病。革蘭氏陰性菌的大腸桿菌是引起奶牛乳腺炎的主要致病菌之一。脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）來源于大腸桿菌的外膜，可刺激乳腺上皮細(xì)胞（MAC-T）分泌多種炎癥因子、趨化因子等，適合用于炎癥狀態(tài)下MAC-T功能的研究。革蘭氏陰性菌的脂多糖在許多其他疾病過程中也表現(xiàn)出相當(dāng)多樣的致病或調(diào)節(jié)作用，一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。

實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞功能分析(real time cell analysis，RTCA)，是利用RTCA儀器，采用非侵入性、基于阻抗的實(shí)時(shí)細(xì)胞生物傳感器系統(tǒng)，通過鍍金傳感器電極的電子電阻讀數(shù)（該電極位于E-Plate16板的底部），對細(xì)胞進(jìn)行不間斷、無標(biāo)記和實(shí)時(shí)分析[1]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，1984年研究人員首次將電子阻抗傳感器用于細(xì)胞過程的實(shí)時(shí)檢測[2]。微電子芯片測得的電阻抗反映了細(xì)胞的生長、伸展、形態(tài)變化、死亡和貼壁等一系列生理狀態(tài)。在電極上細(xì)胞較多的情況下，CI值較高。而且阻抗的變化，還與細(xì)胞黏附在電極上的寬度、數(shù)量和質(zhì)量有關(guān)。RTCA的CI測量可用于細(xì)胞群落變化的全面實(shí)時(shí)監(jiān)測，具有高度的一致性和可重復(fù)性。通過使用這種方法，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測細(xì)胞，并使用CI值作為確定細(xì)胞增殖率、細(xì)胞毒性效應(yīng)和遷移能力的指標(biāo)，而不會(huì)中斷數(shù)據(jù)收集或造成外部誤差。

此外，在RTCA系統(tǒng)運(yùn)行期間，可在任何時(shí)間間隔進(jìn)行終點(diǎn)分析，相比顯微鏡和分子分析等方法具有一定優(yōu)勢[3]。本文利用RTCA S16系統(tǒng)與傳統(tǒng)的CCK-8法對LPS誘導(dǎo)MAC-T增殖情況進(jìn)行監(jiān)測分析，比較兩種方法對奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響，以期從中找到最適的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

奶牛乳腺上皮細(xì)胞（MAC-T）由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)；DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Hyclone 公司；胎牛血清購自以色列Bioind公司；青鏈霉素混合液、1xPBS均購自新鄉(xiāng)智寶生物科技有限公司；脂多糖（LPS）購自美國Sigma公司；Cell Counting Kit-8試劑盒購自北京Solarbio公司；其他化學(xué)試劑購自北京Solarbio公司和上海生工生物有限公司。

1.1.2 主要儀器

超凈工作臺(tái)，由蘇凈集團(tuán)安泰公司生產(chǎn)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，由上海三發(fā)儀器有限公司生產(chǎn)；全波長多功能酶標(biāo)儀，由美國Thermo Scientific公司生產(chǎn)；低溫冰箱，由青島海爾股份有限公司生產(chǎn)；電熱恒溫水浴鍋，由上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；倒置顯微鏡，由德國Carl Zeiss AG公司生產(chǎn)；xCELLigence RTCA S16，由艾森生物（杭州）有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

MAC-T在含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于含有5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞覆蓋瓶底 85%左右時(shí)進(jìn)行傳達(dá)，傳至第3代后可用試驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8法測定細(xì)胞活力

CCK-8法是利用加入的WST-8[化學(xué)名:2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽]被細(xì)胞中的脫氫酶還原為一種高度水溶性的黃色甲臜染料來測定細(xì)胞數(shù)量。此時(shí)用酶標(biāo)儀測定450nm波長處的OD值，在一定細(xì)胞數(shù)的范圍內(nèi)，生成的甲瓚產(chǎn)物的數(shù)量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，測定的OD值越大，活細(xì)胞數(shù)則越多。

實(shí)驗(yàn)時(shí)設(shè)置調(diào)零孔、對照孔（3個(gè)重復(fù)）、LPS孔（每組3個(gè)重復(fù)）。調(diào)零孔不加細(xì)胞；對照孔加細(xì)胞的培養(yǎng)基中不含LPS；LPS孔加含不同濃度的LPS處理液。將1×104/mL MAC-T接種于96板各孔中，待細(xì)胞生長匯合度達(dá)到60%～75%時(shí)，棄去完全培養(yǎng)基，并用PBS沖洗兩次，使用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基代替舊培養(yǎng)基進(jìn)行6h左右的饑餓培養(yǎng)。之后使用不同濃度的 LPS（0、5、10、20ng/μL）處理液與乳腺上皮細(xì)胞分別孵育3h和6h，棄去培養(yǎng)液，用37℃預(yù)熱的PBS緩沖液清洗上皮細(xì)胞2次，加入無血清 DMEM/F-12 的培養(yǎng)液90μL+10μLCCK-8溶液，將96孔板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h，用酶標(biāo)儀測定在450nm處各孔的A值，并計(jì)算不同濃度LPS刺激不同時(shí)間對MAC-T生長的影響。

細(xì)胞活力（%）=[A（LPS）-A（空白）] / [A（O LPS）-A（空白）]×100%

1.2.3 RTCA 法測定細(xì)胞增殖

在細(xì)胞接種前，向E-Plate板的每個(gè)微孔中加入50μL培養(yǎng)基，并在10min內(nèi)將E-Plate板放入RTCA內(nèi)進(jìn)行背景阻抗值檢測。將1×104/mL MAC-T接種于RTCA 的E-Plate 16板各孔中，將E-Plate板置于室溫下孵育30min，使初始細(xì)胞黏附于每個(gè)孔的底部。此后，將E-Plate 板安裝在RTCA上，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞生長至對數(shù)期時(shí)，吸去完全培養(yǎng)基，并用PBS沖洗兩次，使用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基代替舊培養(yǎng)基進(jìn)行6h左右的饑餓培養(yǎng)，之后每組分別加入不同濃度的LPS（0、5、10、20ng/μL）處理液，每組3個(gè)重復(fù)。顯示儀器正常工作的對照組的E-Plate的微孔中只含有培養(yǎng)基不含細(xì)胞。全程每15min測量一次阻抗值，直至試驗(yàn)結(jié)束。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。采用單因素方差分析對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多重比較。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 CCK-8方法條件下不同LPS濃度對奶牛乳腺上皮細(xì)胞（MAC-T）增殖的影響

CCK-8檢測結(jié)果顯示，LPS作用3h和6h后對奶牛乳腺上皮細(xì)胞（MAC-T）均有抑制作用。同一作用時(shí)間隨著LPS濃度增加，MAC-T的活力逐步下降。5ng/μL處理 MAC-T 3h、6h，對MAC-T活力沒有明顯影響（P＞0.05），當(dāng)濃度達(dá)到10ng/μL 時(shí)會(huì)明顯抑制細(xì)胞活力（3h：P＜0.05，6h：P＜0.01），當(dāng)濃度達(dá)到20ng/μL時(shí)能顯著降低細(xì)胞活力（3h：P＜0.01，6h：P＜0.01），表明LPS對MAC-T增殖的影響依賴其濃度和作用時(shí)間（圖1和圖2）。

圖1 不同濃度LPS作用不同時(shí)間對MAC-T活力的影響

圖2 不同濃度LPS作用不同時(shí)間對MAC-T生長的影響

2.2 RTCA條件下不同濃度LPS對奶牛乳腺上皮細(xì)胞（MAC-T）生長的影響

RTCA結(jié)果顯示，在72h的實(shí)時(shí)監(jiān)測中，與不加LPS的對照組相比，不同濃度的LPS組均對MAC-T生長有抑制作用。5ng/μL和10ng/μL對MAC-T生長有輕微的抑制作用，但不同濃度對細(xì)胞生長無明顯影響。20ng/μL濃度的LPS對細(xì)胞生長有明顯抑制作用。在起始階段加入LPS時(shí)（＜1h），細(xì)胞出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)在細(xì)胞CI值降低，但隨著孵育時(shí)間的延長，細(xì)胞曲線趨于平穩(wěn)，更準(zhǔn)確地代表了細(xì)胞真實(shí)的生長狀態(tài)。CI值可隨時(shí)間和劑量而變化，在試驗(yàn)期間產(chǎn)生時(shí)間依賴性和劑量依賴性阻抗曲線。與對照組（LPS 0ng/μL）相比，高濃度LPS（20ng/μL）處理的MAC-T，其CI值明顯降低，表明高濃度LPS對MAC-T具有毒性作用，可明顯抑制MAC-T增殖（圖3）。

圖3 RTCA監(jiān)測LPS對MAC-T生長的影響

3 討論

RTCA系統(tǒng)分析方法具有許多優(yōu)點(diǎn)，在接近細(xì)胞生理狀態(tài)的條件下進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測，能實(shí)現(xiàn)全過程自動(dòng)檢測、連續(xù)檢測的動(dòng)態(tài)化信息數(shù)據(jù)采集，具有較高的準(zhǔn)確性、重復(fù)性，能提供較大的動(dòng)態(tài)檢測范圍和較高的信息含量[4]。相比較CCK-8方法，RTCA法操作簡便并且試驗(yàn)方法簡單，實(shí)驗(yàn)參數(shù)相對較小，可進(jìn)行快速數(shù)據(jù)處理。有研究者用RTCA與傳統(tǒng)的熒光細(xì)胞活性分析法和計(jì)算每個(gè)孔的人工細(xì)胞實(shí)際數(shù)量兩種方法檢測細(xì)胞生長率，結(jié)果顯示RTCA監(jiān)測效果更有優(yōu)勢和效率[5]。此外，有學(xué)者用RTCA考察最佳細(xì)胞培養(yǎng)條件和分析的重復(fù)性，得到了預(yù)期較好的結(jié)果[6]。也有研究表明，RTCA可用于評估某些藥物的臨床前心臟安全性，并可以一種方便的方式提供相對較高的濃度，以篩選藥物的潛在心臟毒性[7]。Kustermann等使用RTCA，通過記錄化合物對細(xì)胞作用的時(shí)間動(dòng)力學(xué)來測量細(xì)胞毒性藥物引起的細(xì)胞抑制，這表明基于阻抗的實(shí)時(shí)細(xì)胞分析可作為一種方便的篩選工具用于進(jìn)一步的表征體外毒性觀察[8]。另外，細(xì)胞指數(shù)的下降不僅是由于細(xì)胞毒性，也可能是其他混雜因素存在造成的。因此，RTCA可以追蹤整個(gè)試驗(yàn)期間的細(xì)胞生長情況，與基于終點(diǎn)的方法CCK-8等相比，使用RTCA更容易注意到細(xì)胞生長的抑制，在細(xì)胞抑制劑研究中尤其有效[9,10]。本試驗(yàn)基于細(xì)胞阻抗檢測細(xì)胞活力，與CCK-8方法結(jié)果一致，在對兩種方法進(jìn)行比較的同時(shí)，也對LPS對MAC-T活力進(jìn)行雙重驗(yàn)證，在最大LPS濃度20ng/μL時(shí)，奶牛乳腺上皮細(xì)胞的活力表現(xiàn)為最低，兩種方法的有效性統(tǒng)一，證明了RTCA方法的可行性較好。

乳牛乳腺炎對奶牛業(yè)危害很大，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌是引起奶牛乳腺炎的病原體，其中，以大腸桿菌為代表的革蘭氏陰性菌占很大比例。LPS作為革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁外膜的主要成分，常被用作誘導(dǎo)奶牛乳腺炎的刺激物。本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度LPS對MAC-T作用不同時(shí)間后，隨著濃度的增加和時(shí)間的延長，MAC-T活力呈現(xiàn)依賴性逐漸降低。本研究對比發(fā)現(xiàn)了LPS對MAC-T生長增殖的影響，但試驗(yàn)條件僅能夠簡單反映炎癥條件下的MAC-T增殖狀態(tài)，而是否能建立LPS誘導(dǎo)MAC-T的炎癥模型，還需進(jìn)一步經(jīng)ELISA和qPCR給予驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究利用RTCA與CCK-8兩種方法分析LPS對奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)RTCA方法可有效地彌補(bǔ)CCK-8方法測定細(xì)胞增殖的局限性，用于實(shí)時(shí)性測試細(xì)胞增殖的效果更好，可作為研究細(xì)胞增殖的較好方法使用。