孔金玉，原 翔，劉怡文，孫 蔚，谷變利，蘭子君，高社干

中國是世界上食管癌發(fā)病率和病死率最高的國家，其中河南省是食管癌高發(fā)區(qū)[1]。食管癌中90%以上為鱗狀細(xì)胞癌[2]。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤發(fā)生的始動細(xì)胞，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及耐藥的決定因素[3]。ALDH1在癌組織中的表達(dá)異常亦為眾多研究文獻(xiàn)所證實[4]。ALDH1在癌組織的表達(dá)情況，通常也提示腫瘤的惡性程度，并且與預(yù)后有關(guān)[5]。但目前很少有研究ALDH1在食管鱗癌組織中的表達(dá)及預(yù)測食管癌患者臨床預(yù)后的文獻(xiàn)報道。本研究通過檢測ALDH1在食管鱗癌組織中的表達(dá)情況，探討其與食管鱗癌的臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，為食管癌早期診斷、分子靶向治療以及更為確切的預(yù)測臨床預(yù)后提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究為回顧性研究，收集2012年1月至2012年12月河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科手術(shù)切除的食管鱗癌患者的組織標(biāo)本100例，其中男62例，女38例；年齡42～79歲，平均61歲，中位年齡62歲；高分化26例，中分化56例，低分化18例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者28例；TNM分期Ⅰ/Ⅱ期74例，Ⅲ期26例。腫瘤標(biāo)本取自原發(fā)灶，取出后甲醛固定，石蠟包埋。所有患者均經(jīng)病理學(xué)確診為食管鱗癌，且術(shù)前均未接受放化療及免疫治療，并于術(shù)前獲得患者書面知情同意。

1.2 主要試劑與儀器ALDH1兔抗人多克隆抗體(ab72543)購自美國Abcam公司；免疫組織化學(xué)SP超敏試劑盒、DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；檸檬酸抗原修復(fù)液(pH6.0)、蘇木精、中性樹膠購自索萊寶生物科技有限公司；光學(xué)顯微鏡購自尼康生物有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測食管鱗癌中ALDH1蛋白的表達(dá)取石蠟包埋的食管鱗癌組織標(biāo)本,制成4 μm厚石蠟切片；于60 ℃溶蠟1.5 h，二甲苯脫蠟3次，每次10 min，100%乙醇、95%乙醇、95%乙醇、85%乙醇梯度水化，經(jīng)0.01 mol·L-1檸檬酸鹽緩沖液抗原高壓熱修復(fù)。用免疫組織化學(xué)SP試劑盒(北京中杉金橋生物科技有限公司 SP-9000)檢測ALDH1蛋白表達(dá)。兔抗人ALDH1多克隆抗體濃度為1∶200。以0.01 moL·L-1的PBS(pH7.5)代替一抗作為陰性對照。觀察食管鱗癌組織中ALDH1蛋白的表達(dá)，以組織中顯示棕黃色為ALDH1表達(dá)陽性。根據(jù)組織切片胞質(zhì)及胞核著色的強度和染色面積進(jìn)行綜合評分，將“-”定為陰性，“+”“++”和“+++”定為陽性。

1.4 隨訪根據(jù)病歷信息記錄電話、地址等，采用門診及電話的方式進(jìn)行隨訪，電話隨訪失敗，則通過地址單位及街道或村委會再次聯(lián)系隨訪，死于其他疾病、失訪或隨訪截止時間仍存活視為截尾數(shù)據(jù)，隨訪截止時間為2017年6月15日。100例患者中死亡60例，均死于食管癌相關(guān)的并發(fā)癥或復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；失訪2例，失訪率為2.00%?？偵嫫?overall survival,OS)定義為從腫瘤確診起至末次隨訪或者任何原因引起的死亡。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，采用卡方檢驗比較ALDH1在食管鱗癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性。應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制生存曲線并以Log-rank檢驗生存時間之間的差異，以COX比例風(fēng)險模型進(jìn)行單因素和多因素分析，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALDH1在食管鱗癌組織中的表達(dá)情況應(yīng)用免疫組化SP法檢測100例食管鱗癌組織中ALDH1蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ALDH1蛋白質(zhì)主要位于細(xì)胞質(zhì)，陽性染色呈棕黃色顆粒；ALDH1在食管鱗癌組織中的陽性率為58.00%(58/100)，見圖1。

A：ALDH1陽性；B：ALDH1陰性。圖1 食管鱗癌組織中ALDH1的表達(dá)(DAB染色，×400)

2.2 ALDH1表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系應(yīng)用χ2檢驗分析ALDH1蛋白表達(dá)與食管鱗癌臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ALDH1蛋白表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期顯著相關(guān)(P<0.05)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中ALDH1陽性率為71.43%，顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(45.83%)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.302，P<0.05)。早期患者(Ⅰ期)中ALDH1蛋白表達(dá)陽性率為33.33%，顯著低于晚期(Ⅲ期)患者(84.62%)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=13.670，P=0.001)。而食管鱗癌組織中ALDH1蛋白表達(dá)與年齡、性別及分化程度無顯著相關(guān)性，見表1。

表1 ALDH1蛋白表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

2.3 ALDH1在食管鱗癌組織中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系應(yīng)用Kaplan-Meier繪制生存曲線并以Log-rank檢驗生存時間之間差異，分析ALDH1蛋白表達(dá)與食管鱗癌患者預(yù)后的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)100例食管鱗癌患者術(shù)后ALDH1蛋白陰性表達(dá)組5 a生存率(51.00%)明顯高于陽性組(23.00%)，提示ALDH1蛋白陽性組生存預(yù)后較差(χ2=8.623，P=0.003)。見圖2。

應(yīng)用COX回歸分析100例成功完成術(shù)后隨訪的食管鱗癌患者，單因素分析結(jié)果顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及ALDH1表達(dá)與總生存期相關(guān)(P<0.05)；COX多因素分析結(jié)果顯示，ALDH1表達(dá)是食管鱗癌獨立的危險因素(P<0.05)，見表2。

圖2 ALDH1表達(dá)在食管鱗癌中的生存曲線

表2 食管鱗癌患者預(yù)后影響因素的COX回歸分析

3 討論

食管癌在我國環(huán)太行山脈附近的省份明顯高發(fā)，其中河南林州是食管癌世界高發(fā)區(qū)[6],因食管癌早期臨床表現(xiàn)缺乏特異性，出現(xiàn)癥狀時大多已屬于晚期(Ⅲ/Ⅳ期)，往往錯過了最佳治療時期，預(yù)后較差，5 a生存率為30%[7]。隨著診療技術(shù)的不斷提高，食管鱗癌5 a生存率有所提高，但總體死亡率仍居高不下。因此，尋找具有特異性和敏感性的腫瘤標(biāo)志物將有利于食管癌的早期發(fā)現(xiàn)，為食管癌治療提供可能的新靶點，具有極其重要的意義。

ALDH1位于細(xì)胞質(zhì)，是一種含鋅酶類，可通過氧化視黃醇參與細(xì)胞的生長和分化。2007年Ginestier等[8]發(fā)現(xiàn)ALDH1是乳腺癌干細(xì)胞的標(biāo)記物，揭開了ALDH1在干細(xì)胞領(lǐng)域研究的篇章。此后，在結(jié)直腸癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、賁門癌、肺癌、膀胱癌等多種腫瘤干細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)有ALDH1表達(dá)[9-14]。目前已證實ALDH1是結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等的通用標(biāo)志物[15-18]。其與患者臨床治療及預(yù)后的相關(guān)性研究亦逐步展開。

本研究表明ALDH1位于細(xì)胞質(zhì)中，食管鱗癌組織中有一定的高表達(dá)率(58.00%)，與現(xiàn)有ALDH1在其它腫瘤組織中的表達(dá)情況一致。同時有研究發(fā)現(xiàn)其在腫瘤組織中表達(dá)或活性與患者的預(yù)后具有顯著的相關(guān)性，Ma等[19]發(fā)現(xiàn)ALDH1高表達(dá)患者的預(yù)后明顯差于ALDH1低表達(dá)患者。宮頸癌組織中ALDH1高表達(dá)是一個獨立的危險因素，它預(yù)示著較低的生存率[20]，在頭頸部腫瘤方面Chen YC等[10]研究也發(fā)現(xiàn)，在頭頸部鱗癌的治療過程中AIDH1高表達(dá)患者顯示出明顯的治療耐受，而低表達(dá)患者在受到相同治療時，表現(xiàn)出較好的治療效果，且預(yù)后優(yōu)于ALDH1高表達(dá)患者。本研究發(fā)現(xiàn)ALDH1蛋白的表達(dá)與腫瘤的臨床TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示ALDH1表達(dá)陽性的患者臨床分期晚、易于轉(zhuǎn)移。這與國外的研究基本一致[21-22]。同時，也說明了食管鱗癌干細(xì)胞具有較強的分化、生長能力，能夠直接導(dǎo)致患者的復(fù)發(fā)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

本研究ALDH1表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期與患者生存率相關(guān)，是影響食管鱗癌患者生存率的獨立預(yù)后指標(biāo)，這與國外的研究相同[23]。這也說明，ALDH1作為食管鱗癌腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物，能夠同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期一樣，預(yù)測食管鱗癌患者的臨床預(yù)后。

總之，ALDH1 在食管鱗癌中有高表達(dá)現(xiàn)象， 且其表達(dá)與患者的臨床預(yù)后密切相關(guān)。ALDH1表達(dá)與食管鱗癌預(yù)后關(guān)系的機制目前尚不明確，但是多種惡性腫瘤組織ALDH1過表達(dá)，而且ALDH1 蛋白陽性表達(dá)的患者總生存率低。ALDH1可能作為食管鱗癌腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物，且有望成為食管癌干細(xì)胞研究和靶向治療的新方向。