焦葉林，劉其偉，阮豪杰，陳 攀，許海軍，李孟祥，齊義軍，高社干

食管鱗癌(Esophageal squamous cell cancer, ESCC)是全球食管癌的主要組織學類型[1]，是中國癌癥死亡四大原因之一，占所有食管癌90%以上[2]。由于大多數(shù)患者在最初診斷時已經(jīng)發(fā)生了轉移，盡管接受了多種治療方案，ESCC患者的5 a總生存率僅有10%[3]。因此，尋求預防、早期診斷和靶向治療的分子標志物至關重要。

慢性感染是腫瘤形成與發(fā)展的重要因素之一，約有20%腫瘤與感染相關[4-5]。口腔牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)不僅能夠引起牙周炎，還與多種全身性疾病密切相關。P.gingivalis富集于ESCC組織并與ESCC低分化、淋巴結轉移及預后不良顯著相關，提示P.gingivalis可能促進了ESCC演進過程[6]。P.gingivalis感染ESCC細胞前后共鑒定出255個差異表達蛋白質分子，其中S100A2表達上調。本研究進一步分析了ESCC組織中P.gingivalis與S100A2表達一致性，并探討了S100A2沉默后阻斷P.gingivalis對ESCC的促進作用。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑RPMI 1640培養(yǎng)基(Hyclone，貨號 SH30809.01B)，胎牛血清(Hyclone，貨號SV30184.02)，GAM細菌培養(yǎng)基(日水制業(yè)株式會社，貨號05433)，RIPA裂解液(Sigma，貨號R0278)，Bradford蛋白定量試劑盒(康為，貨號CW0013)，PVDF膜(Millipore)，顯色液ECL(康為，CW0049A)，β-actin抗兔一抗(CST，貨號4970S)，S100A2抗兔一抗(Abcam，貨號ab109494)，HRP標記羊抗兔二抗(Earth，貨號110581)，細胞侵襲遷移實驗使用Transwell遷移小室(Corning，貨號3422)，Transwell浸潤小室(BD，貨號354480)，細胞轉染siRNAs由上海吉瑪公司合成生產，免疫組化(Immunohistochemistry,IHC)采用鏈霉素抗生素蛋白-過氧化物酶連接法，DAB(索萊寶，貨號DA1010)。

1.2 細胞株、菌株和組織來源本研究中ESCC細胞系KYSE70細胞由本實驗室凍存，P.gingivalisATCC 33277來源于ATCC細胞庫，ESCC組織標本來源于河南科技大學第一附屬醫(yī)院2012年至2017年47例ESCC 患者手術標本。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)KYSE70用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實驗所使用的細胞均處于對數(shù)生長期。

1.3.2P.gingivalis培養(yǎng)和感染P.gingivalis用GAM培養(yǎng)基、37 ℃厭氧條件下(85% N2,10% H2和CO2)培養(yǎng)。P.gingivalis感染細胞用MOI 10。

1.3.3 細胞增殖、遷移、侵襲實驗于96孔板每孔接種2000個，每組3復孔，分別在P.gingivalis感染后4、6、8、12、24、48、72 h終止培養(yǎng)，用MTT法檢測細胞活性，繪制細胞生長曲線。細胞遷移和侵襲實驗采用遷移小室，小室上層接種5.0×104個細胞，培養(yǎng)24～48 h后終止實驗，固定、0.2%結晶紫染色，顯微鏡下隨機選取5個視野計數(shù)。

1.3.4 細胞轉染實驗siS100A2細胞轉染，5 pmol siRNAs和8 μL siRNA-mate混合、室溫孵育10 min，然后加入目標細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h。

1.3.5 蛋白提取細胞培養(yǎng)至收集時，預冷PBS洗3次，加入適量蛋白裂解液，冰上靜置5 min，用細胞刮收集細胞于Ep管，4 ℃、13 000 r·min-1離心10 min，收集上清即提取蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 Western-bloting配制5%濃縮膠和12%分離膠，蛋白樣品30 μg電泳分離，電轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗4 ℃過夜孵育，二抗室溫孵育1 h，ECL顯色。

1.3.7 免疫組化采用鏈霉素抗生素蛋白—過氧化物酶連接法，PBS 1∶500稀釋S100A2一抗，DAB顯色、蘇木素復染檢測組織表達。

1.4 統(tǒng)計學處理統(tǒng)計學分析均采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件分析，免疫組化結果分析采用卡方檢驗，檢驗水準為P<0.05。

2 結果

2.1P.gingivalis誘導S100A2蛋白水平上調P.gingivalis感染ESCC細胞24 h后，Western blot檢測到ESCC細胞KYSE70中S100A2蛋白表達明顯上調(見圖1)。

2.2 S100A2沉默阻斷了P.gingivalis誘導的ESCC細胞的惡性生物學行為siS100A2轉染后，MTT細胞增殖實驗(圖2A)、遷移實驗(圖2B)和侵襲實驗(圖2C)檢測對照細胞和siS100A2轉染KYSE70細胞增殖、遷移和侵襲能力，發(fā)現(xiàn)P.gingivalis感染明顯增強對照細胞的增殖、遷移和侵襲能力，轉染siS100A2的KYSE70細胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯降低，均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.3 ESCC組織中S100A2表達及S100A2與P.gingivalis豐度相關性IHC檢測47例ESCC組織中S100A2表達，發(fā)現(xiàn)ESCC組織中S100A2的表達(圖3A)明顯高于癌旁(圖3B)。卡方分析ESCC中S100A2表達與P.gingivalis相關性，統(tǒng)計學分析結果顯示ESCC中S100A2表達與P.gingivalis豐度呈正相關，P<0.01(圖3B)。

圖2 P. gingivalis感染KYSE70細胞、siS100A2轉染后KYSE70及對照細胞增殖(A)、遷移(B)和侵襲能力(C)變化

圖3 IHC檢測ESCC組織中S100A2表達和P. gingivalis豐度(A)、S100A2和P. gingivalis相關性(B)

3 討論

由于ESCC早期階段缺乏典型臨床癥狀，目前尚缺乏特異、敏感的ESCC腫瘤標志物分子，而食管胃鏡篩查患者依從性差，并且還需專業(yè)醫(yī)務人員，因此，大多數(shù)ESCC患者首次就診時已發(fā)展至中晚期，大于50%中晚期病人就診時已呈現(xiàn)出影像學可見的轉移灶[7-9]。因此，明確ESCC病因、鑒定ESCC分子標志物，是有效預防ESCC發(fā)生、降低ESCC發(fā)生率、提高早期診斷ESCC及靶向治療的基礎。

上消化道微生態(tài)紊亂是ESCC 發(fā)生發(fā)展的重要因素之一[4-6]。正常的食管微生態(tài)主要由以鏈球菌為主的革蘭氏陽性菌構成，而食管炎或Barrett’s食管的微生態(tài)以革蘭氏陰性的厭氧菌為主[10]。流行病學研究表明，口腔P.gingivalis豐度與ESCC發(fā)生風險呈正相關，并且ESCC患者口腔微生態(tài)多樣性顯著減少[7-11]。ESCC組織中P.gingivalis豐度明顯高于癌旁組織，并且與淋巴結轉移呈正相關，與分化程度、生存期呈負相關。

S100A2是 S100 蛋白家族中重要成員，其表達異常與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展相關。S100A2基因位于與上皮細胞分化有關的染色體 1q.21，具有多種生物學功能，如蛋白磷酸化、細胞支架構建及細胞內外鈣離子平衡等[12]。此外，研究者也發(fā)現(xiàn) S100A2的異常表達與腫瘤的演進過程相關，如：胃癌中S100A2表達缺失可導致腫瘤的發(fā)生，并與腫瘤大小、分化、淋巴轉移及預后有關[12-13]。然而，與之相反的是，在大腸癌中，S100A2的過表達增加腫瘤侵襲性[12-14]。Cao等應用IHC分析ESCC中S100A2表達，發(fā)現(xiàn)S100A2 mRNA、蛋白的陽性表達率分別為77.5%和72.5%，而正常食管黏膜全部表達S100A2蛋白及 mRNA，S100A2表達下調與腫瘤分化和淋巴轉移呈負相關[15-16]。相比正常食管黏膜組織，Barrett’s食管癌中S100A2 蛋白表達量明顯增高[15-17]。本研究表明，P.gingivalis能夠誘導S100A2表達上調，ESCC組織中P.gingivalis豐度與S100A2表達呈正相關，且S100A2表達降低后，抑制了P.gingivalis誘導的ESCC細胞增殖、遷移及侵襲能力增加。

本研究結果表明，中國華北ESCC高發(fā)區(qū)P.gingivalis是重要的病因學因素之一，S100A2可能是P.gingivalis促進ESCC演進過程中的重要參與分子之一，是ESCC潛在分子治療靶點。