侯麗麗,王 成,武晉孝 ,林桃桃,郭 禹,劉 星

(1.山西省飼料獸藥監(jiān)察所，山西 太原 030027；2.山西鑫華澤藥業(yè)有限公司，山西 晉中 030900 )

麻杏石甘口服液收載于《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2017版中藥卷，處方由麻黃、苦杏仁、石膏、甘草組成，具有清熱，宣肺，平喘功能，主治肺熱咳喘[1]，處方中麻黃為君藥。麻黃為麻黃科植物草麻黃(Ephedra sinicd Stapf)木賊麻黃或中麻黃的干燥草質(zhì)莖。秋季采割綠色的草質(zhì)莖，曬干。麻黃是特產(chǎn)于中國(guó)而聞名于世界的藥用植物，具有興奮中樞神經(jīng)，誘發(fā)出汗，抗過(guò)敏、抗流感病毒、利尿等作用，在中醫(yī)藥、蒙醫(yī)藥、西醫(yī)藥中都有廣泛的應(yīng)用。麻黃主要成分為生物堿(1%～2%),總生物堿的80%～85%為麻黃堿(左旋麻黃堿，L-ephedrine)；其次為偽麻黃堿(D-pseudo-ephedrine)等。鹽酸麻黃堿為白色針狀結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，是麻黃堿的鹽酸鹽。鹽酸麻黃堿也為制造冰毒的重要原料，已被納入易制毒化學(xué)品管理，麻黃堿是中藥麻黃的有效成分，也可合成，中毒大多由于過(guò)量麻黃堿或麻黃所致，麻黃堿中毒癥狀的發(fā)生主要由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮和周?chē)臄M腎上腺素作用所引起。麻杏石甘口服液標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)鹽酸麻黃堿的含量測(cè)定項(xiàng)，為了更好控制本品質(zhì)量，本試驗(yàn)對(duì)麻杏石甘口服液中鹽酸麻黃堿的含量測(cè)定方法進(jìn)行了研究。

1 儀器和材料

Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)，鹽酸麻黃堿對(duì)照品，批號(hào)171241-201508，純度99.8%，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。麻杏石甘口服液(批號(hào)201805066)，陰性樣品缺麻黃的麻杏石甘口服液(批號(hào)201805066)，250 mL/瓶，均由保定冀中藥業(yè)有限公司提供。乙腈為色譜級(jí)，磷酸、三乙胺、鹽酸為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 高效液相色譜條件 根據(jù)參考文獻(xiàn)[1]方法,色譜柱為 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液(含0.1%三乙胺)(3∶97)，檢測(cè)波長(zhǎng)為207 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取鹽酸麻黃堿對(duì)照品10 mg，置100 mL量瓶中，加0.1 mol/L的鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，精密量取2 mL，置10 mL量瓶中，加0.1 mol/L的鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，即得(每毫升含鹽酸麻黃堿20 μg的溶液)。

2.3 供試品溶液的制備 精密量取本品1 mL，置50 mL 量瓶中，加濃氨溶液1 mL，用三氯甲烷定容至刻度，精密稱(chēng)重，超聲20 min，放冷，用三氯甲烷補(bǔ)足減失的重量，振搖，過(guò)濾，取續(xù)濾液25 mL，加入鹽酸乙醇(1→20)溶液4 mL，水浴蒸干，殘?jiān)?.1 mol/L 的鹽酸溶液溶解，定容至25 mL量瓶中，搖勻，即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備 精密量取本品1 mL，置50 mL量瓶中，加濃氨溶液1 mL，用三氯甲烷定容至刻度，精密稱(chēng)重，超聲20 min，放冷，用三氯甲烷補(bǔ)足減失的重量，振搖，過(guò)濾，取續(xù)濾液25 mL，加入鹽酸乙醇(1→20)溶液4 mL，水浴蒸干，殘?jiān)?.1 mol/L的鹽酸溶液溶解，定容至25 mL量瓶中，搖勻，即得。

2.5 測(cè)定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

2.6 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取供試品溶液10 μL注入色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果表明：鹽酸麻黃堿與相鄰峰達(dá)到基線分離，分離度達(dá)到4.22，鹽酸麻黃堿峰保留時(shí)間為19.5 min，理論板數(shù)為22 381，峰面積為183.1，峰寬0.30 min。試驗(yàn)證實(shí)，該方法系統(tǒng)適用性良好，見(jiàn)圖1。

2.7 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，在上述高效液相色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置出相同的峰，陰性樣品在與對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上，無(wú)吸收峰，說(shuō)明處方中其他成分不影響鹽酸麻黃堿的含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1～3。

2.8 線性關(guān)系試驗(yàn) 取鹽酸麻黃堿對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加0.1 mol/L的鹽酸溶液制成1 mL含鹽酸麻黃堿60 μg的溶液，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別取儲(chǔ)備液適量制成60 μg/mL、40 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶液，濾過(guò)，取續(xù)濾液，分別按上述色譜條件進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積。結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 鹽酸麻黃堿對(duì)照品HPLC色譜圖

圖2 麻杏石甘口服液樣品HPLC色譜圖

圖3 麻杏石甘口服液陰性樣品HPLC色譜圖

表1 線性試驗(yàn)數(shù)據(jù)

以峰面積為縱坐標(biāo)，鹽酸麻黃堿含量(X-mg/mL)為橫坐標(biāo)作線性回歸，回歸方程為：y=23.286x + 11.931，R2= 0.999 9，結(jié)果表明，鹽酸麻黃堿在0.005～0.06 mg/mL(0.05～0.6 μg)范圍內(nèi)，峰面積與鹽酸麻黃堿含量呈良好的線性關(guān)系。見(jiàn)圖4。

圖4 鹽酸麻黃堿線性關(guān)系

2.9 精密度試驗(yàn)

2.9.1 儀器精密度試驗(yàn) 精密吸取20 μg/mL的鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，在上述高效液相色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)測(cè)定6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果見(jiàn)表2。峰面積RSD為0.34%，結(jié)果表明精密度符合規(guī)定。

表2 精密度試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.9.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品樣品，按供試品溶液制備項(xiàng)制備樣品溶液，制備6份供試品溶液，各取10 μL注入色譜儀，在上述高效液相色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。鹽酸麻黃堿含量RSD為 0.87%，表明重復(fù)性好。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.9.3 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖和鹽酸麻黃堿峰面積，結(jié)果見(jiàn)表4。供試品12 h內(nèi)峰面積RSD為1.06%，表明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

表4 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.9.4 加樣回收率試驗(yàn) (1)對(duì)照品溶液制備：取鹽酸麻黃堿對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加0.1 mol/L的鹽酸溶液制成每1 mL含鹽酸麻黃堿300 μg的溶液，即得對(duì)照品溶液。(2)加樣回收樣品溶液制備：精密量取已知含量(0.38 mg/mL)的同一批麻杏石甘口服液樣品0.5 mL，置50 mL量瓶中，加上述對(duì)照品溶液0.6 mL，加濃氨溶液1 mL，加三氯甲烷定容至刻度，精密稱(chēng)重，超聲20 min，放冷，用三氯甲烷補(bǔ)足減失的重量，振搖，過(guò)濾，取續(xù)濾液25 mL，加入鹽酸乙醇(1→20)溶液4 mL，水浴蒸干，殘?jiān)?.1 mol/L的鹽酸溶液溶解，定容至25 mL量瓶中，搖勻，即得。

照上述供試品方法制備6份供試品溶液，取10 μL注入色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算加樣回收率。

回收率=(加對(duì)照品后測(cè)得的含量-加對(duì)照品前的含量)/實(shí)際所加對(duì)照品量×100%。結(jié)果見(jiàn)表5,6份樣品鹽酸麻黃堿的平均回收率為100.22%，RSD為1.47%。

2.10 耐用性試驗(yàn) 取同一批供試品，改變流動(dòng)相溶液比例(乙腈-0.1%磷酸溶液(含0.1%三乙胺)的比例分別為1∶99、5∶95)進(jìn)行測(cè)定；改變檢測(cè)波長(zhǎng)(205 nm，209 nm)進(jìn)行測(cè)定；改變柱溫(28 ℃，32 ℃)進(jìn)行測(cè)定；分別用Thermo scientific BDS HYPERSIL C18 (5 μm，4.6 mm×250mm)，Syncroni AQ C18(5 μm，4.6×150 mm)，Agilent XDB C18(5 μm，4.6×250 mm)3種不同的色譜柱進(jìn)行測(cè)定。

表5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果同一供試品改變流動(dòng)相比例后，RSD為0.77%；同一供試品在3個(gè)波長(zhǎng)下，RSD為0.51%。同一供試品在改變柱溫的條件下，RSD為0.46%。同一供試品在更換不同色譜柱下進(jìn)行測(cè)定，RSD為0.66%。表明儀器條件微小變動(dòng)對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯影響。

2.11 樣品含量測(cè)定 為了充分考慮不同批次產(chǎn)品的含量差異，測(cè)定了19個(gè)不同批次樣品，結(jié)果見(jiàn)表6。鹽酸麻黃堿的含量在0.10～0.88mg/mL之間。

表6 19批樣品含量測(cè)定結(jié)果

4 討論

目前，高效液相色譜法測(cè)定鹽酸麻黃堿含量的流動(dòng)相主要有甲醇-磷酸溶液和乙腈-磷酸溶液系列，《中華人民共和國(guó)獸藥典》2015版二部，以甲醇0.092%磷酸溶液(含0.04%三乙胺和0.02%二正丁醇)(1.5∶98.5)為流動(dòng)相測(cè)定鹽酸麻黃堿的含量[2]，麻杏石甘注射液測(cè)定鹽酸麻黃堿含量[1]用流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸(5∶95)采用其測(cè)定麻杏石甘口服液中鹽酸麻黃堿時(shí)發(fā)現(xiàn)無(wú)法與供試品溶液中其他組分實(shí)現(xiàn)有效分離，最終根據(jù)參考文獻(xiàn)[1-3],以乙腈-0.1%磷酸溶液(含0.1%三乙胺)(3 ∶97)為流動(dòng)相實(shí)現(xiàn)了鹽酸麻黃堿的良好分離。

供試品溶液制備時(shí)比較直接定容與超聲定容提取法的效果，結(jié)果表明，超聲提取更好，采用超聲提取方法，分別超聲處理15、20、30 min，測(cè)定鹽酸麻黃堿的含量，結(jié)果表明，超聲處理20 min與超聲處理則無(wú)明顯差異，故超聲處理時(shí)間定為20 min。

本試驗(yàn)建立麻杏石甘口服液中鹽酸麻黃堿的 HPLC含量測(cè)定方法，簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，為麻杏石甘口服液質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。