喬彥華，姚紫彤，孫 泉，陳柏安，盧 靜

(首都醫(yī)科大學實驗動物部，北京 豐臺 100069)

實驗動物在生命科學研究中應用廣泛，實驗動物的質量直接決定著生命科學研究結果的準確性和可靠性。而病原微生物是影響實驗動物質量的重要因素之一。仙臺病毒(Sendai virus,SV)是嚙齒類動物最難控制的病毒之一，傳染性強且容易擴散。大鼠、小鼠、倉鼠和豚鼠在自然條件下均可感染，大鼠感染仙臺病毒多數呈亞臨床經過，有時可引起肺炎，對使用大鼠進行的麻醉實驗和吸入毒理學研究等均可產生嚴重干擾[1]。

本試驗以屏障設施條件下大鼠感染仙臺病毒為例，重點從墊料及飼養(yǎng)盒、隔離服、飲水瓶等物品的高壓滅菌、飼料的滅菌、動物飲用水的凈化、動物的引進、人員管理、空調設備維護等方面分析感染原因并提出相應的防控措施，為生命科學研究提供高質量的實驗動物。

1 材料與方法

1.1 試驗耗材 121 ℃壓力蒸汽滅菌化學指示卡(四環(huán)生物)，3M嗜熱脂肪桿菌芽孢菌(3M公司)；直徑90 mm一次性滅菌瓊脂培養(yǎng)皿(國藥科興化工產品有限公司)。

1.2 檢測方法

1.2.1 大鼠仙臺病毒檢測 2018年5月，隨機抽取4個小鼠飼養(yǎng)間哨兵鼠共10只(品系為ICR)、 3個大鼠飼養(yǎng)間哨兵鼠共10只(品系為SD)進行實驗動物微生物質量抽檢，檢測單位為中國食品藥品檢定研究院，檢測項目及方法按國標(GB 14922.2-2011 實驗動物微生物學等級及監(jiān)測)進行。

1.2.2 墊料及飼養(yǎng)盒、飲水瓶及隔離服滅菌方法及微生物檢測 使用雙扉脈動真空滅菌器進行高壓濕熱滅菌，滅菌程序為脈動3次、121 ℃ 滅菌30 min、干燥30 min。對滅菌后儲存在潔物間3 d的墊料及飼養(yǎng)盒、飲水瓶、隔離服分別進行取樣檢測，具體如下：隨機抽取3盒墊料(墊料在飼養(yǎng)盒內)，每盒墊料不同部位混合取50 g放入滅菌瓶內，在無菌操作臺內將墊料樣本放入滅菌的裝有適量蒸餾水的錐形瓶中，用滅菌玻璃棒攪拌使其充分溶解，靜置30 min后，用滅菌吸管吸取1 mL注入一次性瓊脂平皿，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落生長情況。隨機抽取3套隔離服及3個飲水瓶，使用無菌棉簽蘸取滅菌水在隔離服上涂抹5 cm×5 cm大小面積，每1套隔離服取樣3個點。使用無菌棉簽蘸取滅菌水在飲水瓶內部涂抹5 cm×5 cm大小面積，將涂抹后的棉簽接種于營養(yǎng)瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落生長情況。

1.2.3 飼料滅菌方法及微生物檢測 購買經Co60照射滅菌的全價顆粒飼料，由非潔凈區(qū)人員用0.5%～2%過氧乙酸噴霧消毒后，碼放在傳遞倉內，再經紫外線消毒20 min后進入潔物間。隨機抽取3袋潔物間內飼料，對同一袋飼料用滅菌鑷子上、中、下3個部位混合取樣，放入滅菌瓶中，在無菌操作臺內將飼料樣本放入滅菌的裝有適量蒸餾水的錐形瓶中，用滅菌玻璃棒攪拌使其充分溶散，靜置30 min后用滅菌吸管吸取1 mL注入一次性瓊脂平皿，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落生長情況。

1.2.4 動物飲水滅菌方法及微生物檢測 動物飲用水由純水系統(tǒng)凈化滅菌后用飲水瓶取用，每季度監(jiān)測1次飲水微生物情況，檢測時用滅菌容器從水龍頭處取1～2 mL動物飲用水，在無菌操作臺內接種于一次性瓊脂平皿中。置于37 ℃培養(yǎng)48 h后，觀察菌落生長情況。

2 結果

2.1 大鼠仙臺病毒檢測 2018年5月，將隨機抽取的10只ICR小鼠及10只SD大鼠送至中國食品藥品檢定研究院按國標要求進行SPF級別微生物檢測。結果顯示，10只小鼠微生物檢測結果均為陰性，10只SD大鼠微生物檢測結果見表1，其中3只大鼠仙臺病毒檢測為陽性，均來自同一個飼養(yǎng)間。

表1 大鼠微生物學檢測

2.2 墊料及飼養(yǎng)盒、飲水瓶、隔離服微生物檢測 為了檢測高壓滅菌效果，對潔物間儲存3 d的墊料、飲水瓶及隔離服分別取樣進行微生物培養(yǎng)，結果顯示，菌落總數均為0(表2)。

表2 墊料、飲水瓶及隔離服微生物檢測

2.3 飼料滅菌效果檢測 為了檢測飼料的滅菌效果，隨機抽取潔物間3袋飼料，每袋飼料分別從上、中、下3個部位混合取樣，微生物培養(yǎng)48 h后，3袋飼料菌落總數均為0，說明飼料滅菌效果符合要求。

2.4 飲水滅菌效果檢測 按國標要求，實驗動物飲用水需為無菌水。從潔凈區(qū)水龍頭取飲水1～2 mL，經微生物培養(yǎng)后觀察，菌落數為0 CFU/皿(表3)，符合要求。

表3 2018年屏障設施動物飲水微生物檢測

3 討論

屏障設施條件下能夠感染大、小鼠的病原微生物有很多，有些病原會引起暴發(fā)流行，甚至毀滅整個動物群，有些人獸共患病原會威脅人類健康，還有些病原雖然不會引起明顯的臨床癥狀，但會對科研工作產生嚴重干擾，如小鼠肝炎病毒、仙臺病毒、鼠支原體等。

世界各地大、小鼠攜帶仙臺病毒的現(xiàn)象非常普遍。尤其是近10多年來，我國實驗大、小鼠中檢出仙臺病毒感染的鼠群數量和樣品陽性率呈上升趨勢，2013年陽性率高達15.87%[2]。王翠娥等對2012-2013年國內多家單位送檢的大小鼠血清進行檢測，發(fā)現(xiàn)大、小鼠仙臺病毒均有較高的陽性率(8.3%、14.0 %)[3]。屏障設施內動物一旦感染仙臺病毒，需要及時隔離感染房間，淘汰鼠群，或通過胚胎移植方式重建鼠群。

屏障設施動物微生物感染的原因有很多，有時為單一因素造成，更多時候是多種因素相互關聯(lián)、共同作用的結果[4]。因此，病原微生物的防控也必須多管齊下，主要從以下三方面入手：人流(人員管理及規(guī)章制度制定)、物流(進入屏障物品的滅菌及引進動物的隔離檢疫)、氣流(設施內環(huán)境空氣潔凈度及空調凈化設備的維護)。

劉艷等對我國1980-2010年實驗動物屏障設施感染事件分析發(fā)現(xiàn)，工作人員的操作不當和失誤等人為因素是引起實驗動物設施感染事件發(fā)生的主要原因[5]。因此，建議制作詳細的標準操作規(guī)程并加強人員培訓，人員進出不同房間時更換一次性PPE(手套、口罩、帽子)，更換墊料最好在生物安全柜內進行，防止氣溶膠產生。

外界病原微生物可能通過未經滅菌或滅菌不徹底的物品進入屏障。因此，筆者對潔物間儲存了3 d的墊料、隔離服、飲水瓶及飼料、動物飲用水進行了微生物培養(yǎng)，結果顯示均無微生物污染。為了保證滅菌效果，建議每次滅菌時除使用化學指示卡外，應定期使用生物指示劑進行監(jiān)測[6]。滅菌器由有資質的專業(yè)人員進行管理和維護，建立設備管理檔案，定期進行儀器維護和檢查。物品盡量隨滅隨用，避免二次污染，物品在潔物間儲存最多不超過3 d[7]。

新引進動物的隱性感染是屏障設施微生物污染的主要原因之一。文中仙臺病毒陽性大鼠所在的飼養(yǎng)間在1個月前有引進動物記錄，且該房間大鼠在此前和此后的定期微生物監(jiān)測(每季度一次)中均未發(fā)現(xiàn)感染仙臺病毒。因此，本次仙臺病毒極有可能來源于此批新引進的動物。由此建議引進新動物時，都要嚴格進行隔離檢疫或生物凈化；購買動物時選擇有生產許可證的大型動物供應商，接收動物時仔細檢查包裝盒，包裝破損的動物不得進入屏障。

屏障設施通過空調凈化系統(tǒng)將溫度、濕度、風量、換氣次數和空氣潔凈度等內環(huán)境指標控制在國標規(guī)定的范圍內。內環(huán)境的穩(wěn)定對于微生物控制非常重要。王晶等的研究表明，飼養(yǎng)活動可使屏障內落下菌與塵埃粒子數明顯升高，飼養(yǎng)結束后噴霧消毒可使屏障內落下菌與塵埃粒子數明顯下降[8]。劉香梅等通過研究發(fā)現(xiàn)，屏障設施由于部分高效過濾器密封不好,導致外界微生物隨氣流進入屏障設施內。由于高效過濾器發(fā)生堵塞,致使換氣次數減少,壓差紊亂,氣體發(fā)生倒流,最終使屏障設施內空氣遭受污染[9]。因此，建議加強對屏障設施內環(huán)境的維持性消毒，定期監(jiān)測落下菌及塵埃粒子數，定期更換空調過濾器。

除了從人流、物流、氣流三方面切斷病原微生物進入屏障設施的途徑外，應定期對實驗動物進行微生物學監(jiān)測，目前，國內外檢測機構多采用血清學檢測方法[10]。但由于ELISA試劑盒不同批次、操作人員及儀器存在差異等原因，檢測結果會出現(xiàn)假陽性和假陰性現(xiàn)象。因此，針對陽性結果，建議更換實驗室或試劑盒進行復核?；蛴肊LISA和IFA法進行比對檢測，可降低假陽性和假陰性結果的出現(xiàn)率[11]。