（衢州市人民醫(yī)院 腫瘤放療科，浙江 衢州 324000）

結(jié)直腸癌是西方國(guó)家癌癥相關(guān)死亡的第2大主要原因[1]。當(dāng)前，用于晚期結(jié)直腸癌治療的主流藥物包括氟尿嘧啶、卡培他濱、奧沙利鉑等，可以單獨(dú)使用，也可兩種聯(lián)合使用[2]。由于其毒性和不良事件，這些治療藥物的應(yīng)用均受到限制。進(jìn)一步了解結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制，可為新藥研究和個(gè)體化治療提供支持。

γδ T細(xì)胞是不同于傳統(tǒng)αβ T細(xì)胞的一群T淋巴細(xì)胞，占人體外周血CD3 T細(xì)胞的1%～10%[3]，γδT細(xì)胞一直被視為機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的重要成員之一[4]。γδT細(xì)胞可進(jìn)一步分為2個(gè)細(xì)胞亞群：Vδ1 T細(xì)胞（主要分布于上皮性相關(guān)的淋巴組織）和Vδ2 T細(xì)胞（主要分布于外周血）[5]。Vδ2 T細(xì)胞主要參與機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫監(jiān)視和對(duì)病原體侵襲的防御反應(yīng)[6-9]，是γδT細(xì)胞發(fā)揮抗感染和抗腫瘤免疫作用的主要亞群；而Vδ1 T細(xì)胞主要具有免疫調(diào)節(jié)功能[10]，目前認(rèn)為與某些腫瘤，如乳腺癌的免疫逃逸相關(guān)。

γδT細(xì)胞因其獨(dú)特的組織相容性復(fù)合體（MHC）非限制性識(shí)別腫瘤抗原的特點(diǎn)而成為腫瘤免疫治療的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察結(jié)直腸癌患者外周血和腫瘤組織γδ T細(xì)胞及各亞群的比例及功能變化情況，探討γδT細(xì)胞及各亞群在結(jié)直腸癌發(fā)病中的可能作用，為未來(lái)以γδT細(xì)胞為基礎(chǔ)免疫療法的應(yīng)用提供一些科學(xué)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年9月30日—2017年10月31日衢州市人民醫(yī)院接受手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者20例為癌癥組。所有入組者術(shù)前均未接受任何化學(xué)治療、放射治療或免疫治療；于術(shù)中收集癌癥組癌組織和癌旁組織標(biāo)本，均經(jīng)過(guò)組織病理學(xué)診斷證實(shí)為結(jié)直腸癌。同時(shí)收集該院健康體檢的20例作為對(duì)照組。癌癥組的平均年齡（51.09±13.26）歲，對(duì)照組的平均年齡（49.85±15.83）歲。標(biāo)本的收集符合本院倫理委員會(huì)的要求。

1.2 主要試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，F(xiàn)ITC-抗人TCRγδ（IMMU510）以及抗人TCR-γδ單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter Immunotech公司，APC-c抗人CD3（HIT3a）、FITC-抗 人 TCR Vδ2（B6） 購(gòu)自美國(guó) Biolegend公司，F(xiàn)ITC-抗人TCR Vδ1（TS8.2）購(gòu)自美國(guó)Pierce公司，Cell TraceTMCFSE 細(xì)胞增殖 Kit 購(gòu)自美國(guó) Invitrogen公司，白細(xì)胞介素-2購(gòu)自日本United Pharmaceutical（Far East）Limited 公司。

1.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞獲取方法

清晨抽取兩組的外周血，以枸櫞酸鈉抗凝管收置；并以無(wú)菌RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋1倍。按稀釋血液∶淋巴細(xì)胞分離液2∶1的比例計(jì)算淋巴細(xì)胞分離液體積，并于離心管中加入適量淋巴細(xì)胞分離液，隨后將稀釋后的外周血緩慢加入離心管中，并確保稀釋血置于淋巴細(xì)胞分離液上層，2 000 r/min 離心 20 min。離心后的血液分為4層，從上至下依次為：血清層、白膜層、淋巴細(xì)胞分離液層和紅細(xì)胞層。采用吸管輕輕吸取中間白色的淋巴細(xì)胞白膜層，加入預(yù)裝10 ml無(wú)菌RPMI 1640 培養(yǎng)基的離心管中，1 800 r/min 離心 15 min。棄盡無(wú)菌 RPMI 1640 培養(yǎng)基，以 10 ml無(wú)菌 RPMI 1640 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，1 500 r/min 離心 8 min。獲取的細(xì)胞即為外周血單個(gè)核細(xì)胞，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 T細(xì)胞獲取方法

結(jié)直腸癌組織以機(jī)械研磨的方法獲得T細(xì)胞，具體方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[11]。

1.5 結(jié)直腸癌組織及外周血γδT細(xì)胞的培養(yǎng)

結(jié)直腸癌組織以機(jī)械研磨的方法獲得T細(xì)胞?？鼓庵苎訤icoll-PaqueTMPREMIUM分離獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞。所獲T細(xì)胞及外周血單個(gè)核細(xì)胞以固相包被抗人TCR-γδ單克隆抗體（0.25 μg/cm2）進(jìn)行刺激，所用培養(yǎng)基為含200 IU/ml白細(xì)胞介素-2及10%胎牛血清的RPMI 1640。細(xì)胞置于37℃、5%二氧化碳CO2條件下培養(yǎng)2～4周，其間每2～3天進(jìn)行傳代。

1.6 表面分子的免疫熒光染色

收集約1×106個(gè)的外周血單個(gè)核細(xì)胞和T細(xì)胞，以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）（含1%牛血清白蛋白的PBS）洗滌1次。隨后采用50 μl PBS重懸細(xì)胞，根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)要求加入適量熒光標(biāo)記抗體，4℃避光孵育20 min。PBS洗滌2次，重懸于500 μl含1%多聚甲醛的PBS固定液中用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.7 免疫抑制功能檢測(cè)

采用流式分選方法獲取經(jīng)擴(kuò)增后的Vδ1 T細(xì)胞和對(duì)照組外周血 Na?ve CD4 T 細(xì)胞。分選獲取的 Vδ1 T細(xì)胞和對(duì)照組外周血Na?ve CD4 T細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)純度 ＞90%。Vδ1 T 細(xì)胞抑制 Na?ve CD4 T 細(xì)胞增殖能力檢測(cè)時(shí)，需預(yù)先在96孔板中包被1 μg/mlCD3抗體及2 μg/ml CD 28 抗體，并放置在 37℃孵箱中孵育至少 2 h ；實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，Na?ve CD4 T 細(xì)胞按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行 CFSE 染色，染色結(jié)束后 Na?ve CD4 T 細(xì)胞以 RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸后，加入96孔板中，進(jìn)行Vδ1 T細(xì)胞抑制 Na?ve CD4 T 細(xì)胞能力檢測(cè)時(shí)，將Vδ1 T 細(xì)胞和Na?ve CD4 T細(xì)胞按1∶1比例加入96孔板中；各組細(xì)胞在37℃孵箱中孵育5 d后收取細(xì)胞用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血γδ T細(xì)胞比例

對(duì)照組和癌癥組外周血γδ T細(xì)胞比例為（5.7±1.9）%和（5.5±2.3）%，兩組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.300，P =0.766）；對(duì)照組和癌癥組外周血Vδ1 T細(xì)胞比例為（1.1±0.5）%和（3.2±0.9）%，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.702，P=0.004），癌癥組外周血Vδ1 T細(xì)胞比例升高；對(duì)照組和癌癥外周血Vδ2 T細(xì)胞比例為（4.5±1.5）%和（2.2±0.7）%，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.366，P=0.006），癌癥組外周血Vδ2 T細(xì)胞比例降低。見(jiàn)圖1。

2.2 癌癥組癌旁組織和癌組織γδ T細(xì)胞比例

癌旁組織和癌組織γδT細(xì)胞比例為（6.1±2.1）%和（5.9±2.2）%，兩者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.294，P=0.770）；癌旁組織和癌組織 Vδ1 T細(xì)胞比例為（1.1±0.5）%和（3.6±1.2）%，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.059，P=0.008），癌組織 Vδ1 T細(xì)胞比例升高；癌旁組織和癌組織Vδ2 T細(xì)胞比例為（5.5±2.1）%和（2.8±1.4）%，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.248，P=0.005）；癌組織 Vδ2 T 細(xì)胞比例降低。見(jiàn)圖2。

2.3 外周血及癌旁組織、癌組織γδT細(xì)胞增殖能力

對(duì)照組外周血γδT細(xì)胞經(jīng)抗體擴(kuò)增后，總γδT細(xì)胞比例為（86.8±14.2）%，Vδ1 T 細(xì)胞比例為（6.4±4.8）%，Vδ2 T細(xì)胞比例為（74.2±18.5）%；癌癥組外周血γδT細(xì)胞經(jīng)抗體擴(kuò)增后，總γδT細(xì)胞比例為（83.5±11.5）%，Vδ1 T 細(xì)胞比例為（41.5±8.4）%，Vδ2 T細(xì)胞比例為（28.4±15.3）%。與對(duì)照組比較，癌癥組總γδT細(xì)胞的擴(kuò)增能力無(wú)改變（P＞0.05），而不同亞型的γδT細(xì)胞，即Vδ1 T細(xì)胞的擴(kuò)增能力提高（t=10.529，P=0.007），Vδ2 T 細(xì)胞的擴(kuò)增能力降低（t=8.532，P=0.004）。癌癥組癌旁組織 γδT 細(xì)胞經(jīng)抗體擴(kuò)增后，總γδT細(xì)胞比例為（85.3±18.3）%，Vδ1 T 細(xì)胞比例為（24.5±12.8）%，Vδ2 T 細(xì)胞比例為（55.3±15.2）%；癌癥組癌組織γδT細(xì)胞經(jīng)抗體擴(kuò)增后，總γδT細(xì)胞比例為（84.9±12.6）%。Vδ1 T 細(xì)胞比例為（60.6±13.7）%，Vδ2 T 細(xì)胞比例為（21.8±12.6）%。與癌旁組織比較，癌組織總γδ T 細(xì)胞的擴(kuò)增能力無(wú)改變（t=0.081，P=0.936），而不同亞型的γδ T細(xì)胞，即Vδ1 T細(xì)胞的擴(kuò)增能力提高，而Vδ2 T細(xì)胞的擴(kuò)增能力降低。同時(shí)，結(jié)果顯示，癌癥組癌旁組織Vδ1 T細(xì)胞的擴(kuò)增能力高于對(duì)照組外周血 Vδ1 T 細(xì)胞的擴(kuò)增能力（t=10.315，P=0.004），而Vδ2 T細(xì)胞的擴(kuò)增能力低于對(duì)照組外周血Vδ2 T細(xì)胞的擴(kuò)增能力（t=8.734，P=0.002）。見(jiàn)圖3。

圖1 兩組外周血γδ T細(xì)胞比例

圖2 癌癥組癌旁組織和癌組織γδ T細(xì)胞比例

2.4 兩組Vδ1 T細(xì)胞的免疫抑制能力

對(duì)照組外周血Na?ve CD4細(xì)胞單獨(dú)的增殖能力為（90.7±15.7）%，Na?ve CD4細(xì)胞與對(duì)照組外周血Vδ1 T細(xì)胞共培養(yǎng)后，Na?ve CD4 細(xì)胞單獨(dú)的增殖能力為（67.5±11.4）%，Na?ve CD4細(xì)胞與癌癥組外周血Vδ1 T細(xì)胞共培養(yǎng)后，Na?ve CD4細(xì)胞單獨(dú)的增殖能力為（44.8±8.8）%，Na?ve CD4 細(xì)胞與癌旁組織 Vδ1 T細(xì)胞共培養(yǎng)后，Na?ve CD4細(xì)胞單獨(dú)的增殖能力為（52.8±7.9）%，Na?ve CD4 細(xì)胞與癌組織 Vδ1 T 細(xì)胞共培養(yǎng)后，Na?ve CD4細(xì)胞單獨(dú)的增殖能力為（33.6±7.7）%；癌癥組外周血和癌組織浸潤(rùn)Vδ1 T細(xì)胞的免疫抑制功能較癌旁組織增強(qiáng)（t=6.067和5.179，P=0.002和0.003），癌旁組織Vδ1 T細(xì)胞的免疫抑制功能亦增強(qiáng)（t=4.872，P=0.003），但仍低于癌癥組外周血和癌組織的Vδ1 T細(xì)胞免疫抑制能力。見(jiàn)圖4。

圖3 外周血及癌旁組織、癌組織γδ T細(xì)胞的增殖能力

圖4 結(jié)直腸癌患者Vδ1 T細(xì)胞免疫抑制能力

3 討論

本研究結(jié)果顯示與對(duì)照組比較，癌癥組外周血、癌旁組織和癌組織總γδT細(xì)胞比例并未出現(xiàn)變化。γδT細(xì)胞主要分為2個(gè)細(xì)胞亞群：Vδ1 T細(xì)胞和Vδ2 T細(xì)胞[5]。對(duì)γδT細(xì)胞及其不同亞群的分析結(jié)果顯示，癌癥組外周血和癌組織的γδT細(xì)胞比例并未出現(xiàn)變化，而對(duì)不同亞群的分析結(jié)果顯示，Vδ1 T細(xì)胞比例升高，Vδ2 T細(xì)胞比例降低。且在體外經(jīng)抗TCRγδ抗體刺激及IL-2存在條件下培養(yǎng)14 d后，對(duì)照組和癌癥組外周血、癌旁組織和癌組織的VδT細(xì)胞純度均可達(dá)80%以上，然而對(duì)照組的VδT細(xì)胞以Vδ2 T細(xì)胞為主，Vδ1 T細(xì)胞只占很小的一部分，癌癥組癌旁組織擴(kuò)增后Vδ1 T細(xì)胞比例有一定程度升高，但仍以Vδ2 T細(xì)胞為主，而癌癥組外周血和癌組織的VδT細(xì)胞則以Vδ1 T細(xì)胞為主，Vδ2 T細(xì)胞只占很小的一部分。進(jìn)一步功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者外周血Vδ1 T細(xì)胞的免疫抑制功能增強(qiáng)。至此，筆者的研究結(jié)果初步提示，癌癥組外周血和癌組織中Vδ1 T細(xì)胞和Vδ2T細(xì)胞比例的分布不平衡，以及Vδ1 T細(xì)胞的異常活化狀態(tài)和抑制功能的增強(qiáng)，使癌癥組機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài)，從而有利于腫瘤逃避免疫監(jiān)視，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

過(guò)繼免疫療法一直被研究者關(guān)注并用于癌癥的治療[12]。過(guò)繼免疫治療是將供體的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移給受體，增強(qiáng)其細(xì)胞免疫功能，使其獲得抗腫瘤免疫力。γδT細(xì)胞因其獨(dú)特的MHC非限制性抗原識(shí)別能力，同時(shí)兼具NK細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）和T輔助細(xì)胞（Th）的功能特點(diǎn)，因此成為腫瘤免疫治療的研究熱點(diǎn)[13]。γδT細(xì)胞包括2個(gè)主要的亞群，即Vδ1 T 細(xì)胞和Vδ2 T 細(xì)胞，其中的 Vδ2 T 細(xì)胞主要參與機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫監(jiān)視和對(duì)病原體侵襲的防御反應(yīng)，因此Vδ2 T細(xì)胞過(guò)繼治療研究越來(lái)越多，多種腫瘤患者在化療后的合適時(shí)間給予Vδ2 T細(xì)胞和唑來(lái)磷酸可大幅度提高抗腫瘤療效[14]。同時(shí)，研究者發(fā)現(xiàn)Vδ1 T細(xì)胞在腫瘤患者體內(nèi)主要發(fā)揮免疫抑制功能進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[15]。目前關(guān)于γδT細(xì)胞在結(jié)直腸癌的研究還很少，且很少有研究同時(shí)關(guān)注外周血、癌旁組織和癌組織。本研究亦希望通過(guò)對(duì)結(jié)直腸癌患者外周血、癌旁組織和癌組織中γδT細(xì)胞的研究為未來(lái)結(jié)直腸癌的過(guò)繼免疫治療提供一定的科學(xué)依據(jù)。

本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，癌癥組外周血Vδ1 T細(xì)胞比例升高，Vδ2 T細(xì)胞比例降低。除外周血外，本研究還進(jìn)一步對(duì)癌組織中γδ T細(xì)胞及其亞群進(jìn)行分析，結(jié)果與外周血一致，與癌旁組織比較，癌組織Vδ1 T細(xì)胞比例升高，Vδ2 T細(xì)胞比例降低。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，在體外經(jīng)擴(kuò)增后癌癥組外周血和癌旁組織、癌組織的Vδ T細(xì)胞均以Vδ1 T細(xì)胞為主，Vδ2 T細(xì)胞只占很小的一部分。這一結(jié)果與結(jié)直腸癌患者外周血VδT細(xì)胞是以Vδ1 T細(xì)胞為主相一致。正如前言部分所介紹，Vδ2 T細(xì)胞是一種具有腫瘤殺傷功能的細(xì)胞，而Vδ1 T細(xì)胞則以免疫抑制功能為主。據(jù)此，本研究進(jìn)一步對(duì)Vδ1 T細(xì)胞的免疫抑制功能進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者外周血和癌旁組織、癌組織的Vδ1 T細(xì)胞免疫抑制功能增強(qiáng)。

綜上所述，本研究結(jié)果初步提示，癌癥組外周血和癌組織Vδ1 T細(xì)胞和Vδ2 T細(xì)胞比例失衡，從而使患者機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài)，這可能是結(jié)直腸癌逃避機(jī)體免疫監(jiān)視的途徑之一。癌癥組外周血γδT細(xì)胞及不同細(xì)胞亞群的比例及功能變化可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。