（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 骨傷科，江蘇 南京 210000)

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis,KOA）是一種累及整個關(guān)節(jié)的退行性疾病，其主要危險因素包括年齡、遺傳、肥胖及損傷。該病的病理特征是軟骨退化、骨贅形成、軟骨下骨改變及滑膜炎癥[1-2]。目前對KOA的病理機(jī)制尚未完全了解，研究主要集中在生物力學(xué)方向，軟骨退化往往被認(rèn)為是主要的發(fā)病原因[3]。關(guān)節(jié)軟骨包括由蛋白多糖和膠原組成的水合細(xì)胞外基質(zhì)，以及負(fù)責(zé)維持細(xì)胞外基質(zhì)的軟骨細(xì)胞。細(xì)胞外基質(zhì)的代謝平衡受多種因素的影響，軟骨細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）發(fā)揮重要作用[4]。

瞬時感受器電位離子通道家族（transient receptor potential,TRP）香草素受體亞家族成員Ⅳ型（transient receptor potential vanilloid receptor 4,TRPV4）是位于細(xì)胞膜上的非選擇性陽離子通道，可被滲透壓、機(jī)械刺激、佛波酯等多種因素激活[5-7]?；罨腡RPV4引起Ca2+離子的大量涌入，隨后激活細(xì)胞內(nèi)信號通路[8]。近年來，大量的動物模型研究發(fā)現(xiàn)，TRPV4介導(dǎo)軟骨細(xì)胞的代謝調(diào)節(jié)[9-11]，其中涉及的具體機(jī)制卻尚未明晰。

TRPV4感受機(jī)械刺激并參與軟骨降解的特點與KOA的病理機(jī)制十分契合。本實驗提取KOA軟骨細(xì)胞，并用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）刺激模擬KOA病程中的炎癥環(huán)境，觀察TRPV4通道的功能狀態(tài)，以及TRPV4通道與MMP-1、MMP-3和MMP-13的聯(lián)系，試圖闡釋TRPV4通道參與KOA軟骨降解的病理機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司），LPS、膠原酶Ⅱ型（美國Sigma公司），Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）檢測試劑盒（大連寶生生物工程有限公司），選擇性TRPV4通道激動劑GSK-1016790A（美國Abcam公司），F(xiàn)luo-4熒光染料（HY-D0041，美國MCE公司），HEPES緩沖液、MMP-1、MMP-3及MMP-13酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

純水儀（Synergy，美國Millipore公司），混合球磨儀（MM400，德國Retsch公司），垂直流超凈工作臺（ACB-4A1，新加坡ESCO公司），倒置顯微鏡（德國 Leica公司），核酸蛋白檢測儀（Bio Photometer plus）、高速冷凍離心機(jī)（5810R/5417R）及逆轉(zhuǎn)錄PCR儀（德國 Effendorf Minispin公司），qRT-PCR 儀（7500，美國Applied Biosystems公司），激光掃描共聚焦顯微鏡（LSM710，德國Carl Zeiss公司），酶標(biāo)儀（BioTek-ElX800，美國Biotech公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 人類軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng) 選取全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者替換的軟骨組織標(biāo)本。患者知情同意，診斷符合美國風(fēng)濕病學(xué)會分類標(biāo)準(zhǔn)，實驗經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。軟骨組織用含有雙抗（青霉素100 u/ml和鏈霉素100 mg/L）的磷酸鹽緩沖液沖洗2或3次，手術(shù)刀尖削取關(guān)節(jié)表面軟骨，眼科剪剪碎成小塊。0.1%Ⅱ型膠原酶消化60 min后，全培（20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，含1%青霉素和鏈霉素）終止消化。70目篩網(wǎng)過濾入離心管，1 500 r/min離心3 min，棄上清液。全培重懸后移入培養(yǎng)皿，37℃、二氧化碳CO2培養(yǎng)箱孵育，隔日換液。隨后每5天換液，持續(xù)2周，獲得人類原代軟骨細(xì)胞。

1.3.2 LPS 干預(yù)軟骨細(xì)胞模擬 KOA 炎癥環(huán)境 將培養(yǎng)的KOA軟骨細(xì)胞接種于24孔板，分別用濃度為0、1、10和100 ng/ml，以及濃度為 1和10 μg/ml的 LPS全培孵育24 h，或用濃度為1 μg/ml的LPS全培孵育0、4、8、12、24和48 h。

1.3.3 qRT-PCR 檢測 采用 Trizol提取 LPS 干預(yù)后各組軟骨細(xì)胞的總RNA，分光光度計測定RNA濃度和純度，A260nm/A280nm比值在1.8～2.0可用于逆轉(zhuǎn)錄?？?RNA 加入 PrimeScript ? RT reagent Kit 10μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，按 37℃預(yù)變性 15min、85℃變性 5s的反應(yīng)條件在PCR儀上行逆轉(zhuǎn)錄后，置入4℃冰箱保存。Oligo V7軟件設(shè)計引物并交由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，目的基因TRPV4正向引物序列：5'-ACCTT CAGCACCTTCCTCCT-3'，反向引物序列：5'-AGGGCGAT GAGCATGTTAAG-3'；內(nèi)參照基因GAPDH正向引物序列：5'-ACAGCAACAGGGTGGGTGGTGGAC-3'，反向引物序列：5'-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'。參照SYBR Green PCR試劑盒說明書擴(kuò)增，繪制熔解曲線。結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參半定量計算，采用2-△△Ct計算法（△Ct=樣本Ct值-內(nèi)參Ct值）對目的基因的相對表達(dá)量進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA） 將KOA軟骨細(xì)胞接種于6孔板，分為空白組、LPS組、LPS+TRPV4抑制劑組。LPS+TRPV4抑制劑組提前用TRPV4抑制劑孵育1h。LPS組、LPS+TRPV4抑制劑組用濃度為1μg/ml的LPS全培，空白組用正常細(xì)胞培養(yǎng)液全培。24h后收集上清液。ELISA檢測LPS干預(yù)后各組上清液中MMP-1、MMP-3及MMP-13的表達(dá)水平。參照ELISA試劑盒說明書操作。

1.3.5 實時熒光鈣成像 KOA 軟骨細(xì)胞接種于共聚焦小皿，分為空白組、LPS組及LPS+TRPV4抑制劑組，各組干預(yù)方式如前所述。培養(yǎng)24h后，各組均用含 5μmol/L Fluo-4 的 HEPES 緩沖液孵育 30min。隨后通過激光掃描共聚焦顯微鏡，實時加入工作濃度的TRPV4激動劑10μl，在495/518nm的激發(fā)波長處記錄Ca2+流入胞內(nèi)引起的熒光強(qiáng)度變化，持續(xù)記錄2min。各組分別觀察記錄。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS的刺激增加TRPV4通道在人類KOA軟骨細(xì)胞中的表達(dá)

空白組、1ng/ml LPS 組、10ng/ml LPS 組、100ng/ml LPS 組、1μg/ml LPS 組及10μg/ml LPS 組的 TRPV4 mRNA相對表達(dá)量分別為（0.996±0.065）、（1.102±0.093）、（1.948±0.060）、（2.335±0.147）、（3.041±0.195）和（1.745±0.206）。各組軟骨細(xì)胞 TRPV4 mRNA相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=149.52，P=0.000）。空白組與 1ng/ml LPS 組比較，差異無統(tǒng)計意義（t=1.213，P=0.237）；空白組與 10ng/ml LPS 組比較，10ng/ml LPS 組升高（t=10.719，P=0.000）；空白組與100ng/ml LPS 組比較，100ng/ml LPS 組升高（t=15.033，P=0.000）；空白組與 1μg/ml LPS 組比較，1μg/ml LPS組升高（t=22.989，P=0.000）；空白組與 10μg/ml LPS組比較，10μg/ml LPS 組升高（t=8.427，P=0.000）；10μg/ml LPS 組與 1μg/ml LPS 組比較，10μg/ml LPS組降低（t=14.562，P=0.000）。軟骨細(xì)胞在 1μg/ml LPS的刺激下，TRPV4 mRNA相對表達(dá)量達(dá)到峰值。

使用濃度為1μg/ml LPS分別刺激人類KOA軟骨細(xì)胞 0、4、8、12、24和48h，TRPV4 mRNA 相對表達(dá)量分別為（0.980±0.053）、（1.060±0.029）、（1.984±0.084）、（2.610±0.074）、（3.931±0.073）和（2.383±0.075）。各組軟骨細(xì)胞TRPV4 mRNA相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1325.846，P=0.000）。0 h組與 4h組比較，差異無統(tǒng)計意義（t=1.878，P=0.073）；0h 組與 8h 組比較，8h 組升高（t=23.568，P=0.000）；0h組與12h組比較，12h組升高（t=38.263，P=0.000）；0h 組與 24h 組比較，24h 組升高（t=69.249，P=0.000）；0h 組與 48h 組比較，48h 組升高（t=32.864，P=0.000）；48h 組與 24h 組比 較，48h 組降低（t=36.385，P=0.000）。LPS 孵育 24h 后，TRPV4 mRNA相對表達(dá)量達(dá)到峰值。

2.2 TRPV4通道在人類KOA軟骨細(xì)胞中功能性表達(dá)

使用實時熒光鈣成像來觀察TRPV4通道在人類KOA軟骨細(xì)胞中的功能性表達(dá)。3組軟骨細(xì)胞在20、40和60s的熒光強(qiáng)度經(jīng)重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點間的熒光強(qiáng)度有差異（F=147.001，P=0.000）；②3組的熒光強(qiáng)度有差異（F=36.337，P=0.000）；③3組的熒光強(qiáng)度變化趨勢有差異（F=262.411，P=0.000）。20s時，LPS 組與空白組比較，LPS組升高；LPS+抑制劑組與LPS組比較，LPS+抑制劑組降低。40s時，LPS組與空白組比較，LPS組升高；LPS+抑制劑組與LPS組比較，LPS+抑制劑組降低。60s時，LPS組與空白組比較，LPS組升高；LPS+抑制劑組與LPS組比較，LPS+抑制劑組降低。見表1和圖1。

2.3 抑制TRPV4通道可以降低細(xì)胞培養(yǎng)上清中MMPs的表達(dá)

3組軟骨細(xì)胞MMP-1、MMP-3及MMP-13的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。LPS組的MMP-1與空白組比較，LPS組升高（t=9.306，P=0.000）；LPS+TRPV4抑制劑組的MMP-1與LPS組比較，LPS+TRPV4 抑制劑組降低（t=4.234，P=0.001）。LPS 組的MMP-3與空白組比較，LPS組升高（t=13.962，P=0.000）；LPS+TRPV4抑制劑組的MMP-3與LPS組比較，LPS+TRPV4 抑制劑組降低（t=8.690，P=0.000）。LPS 組的MMP-13與空白組比較，LPS組升高（t=19.108，P=0.000）；LPS+TRPV4抑制劑組的MMP-13與LPS組比較，LPS+TRPV4抑制劑組降低（t=10.620，P=0.000）。見表2。

表1 各組軟骨細(xì)胞20、40和60 s實時熒光強(qiáng)度比較（±s）

表1 各組軟骨細(xì)胞20、40和60 s實時熒光強(qiáng)度比較（±s）

注：①與空白組比較，P ＜0.05；②與LPS組比較，P ＜0.05。

組別 20 s 40 s 60 s空白組0.942±0.109 1.094±0.559 1.350±0.059 LPS組1.958±0.267① 4.412±0.354① 5.556±0.101①LPS+TRPV4抑制劑組1.220±0.172② 2.278±0.318② 2.988±0.088②F 值 36.747 185.501 3 143.136 P值 0.000 0.000 0.000

圖1 TRPV4通道在人類KOA軟骨細(xì)胞中的功能性表達(dá)

表2 各組軟骨細(xì)胞MMP-1、MMP-3及MMP-13水平比較 （ng/ml，±s）

表2 各組軟骨細(xì)胞MMP-1、MMP-3及MMP-13水平比較 （ng/ml，±s）

注：①與空白組比較，P ＜0.05；②與LPS組比較，P ＜0.05。

組別 MMP-1 MMP-3 MMP-13空白組27.996±4.726 47.332±3.169 5.952±1.742 LPS組60.468±7.186① 73.134±2.507① 28.434±2.461①LPS+TRPV4抑制劑組45.694±4.162② 57.074±3.047② 15.938±1.137②F值 43.418 99.405 183.283 P值 0.000 0.000 0.000

3 討論

本研究首次證實，TRPV4機(jī)械敏感離子通道在人類軟骨細(xì)胞的表達(dá)。此外，用LPS持續(xù)刺激以模擬KOA的炎癥環(huán)境，觀察TRPV4的功能性表達(dá)，以及是否與MMPs家族存在聯(lián)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在LPS的刺激下，TRPV4的基因表達(dá)增加，濃度為1μg/ml的LPS能最大限度增加TRPV4的表達(dá)，同時，TRPV4的表達(dá)隨刺激時間的增多而增加，在24h達(dá)到最高值，隨后出現(xiàn)降低，據(jù)猜測，這種降低有可能是LPS毒性對細(xì)胞活性存在影響。實時熒光鈣成像分別觀察20、40和60s的熒光強(qiáng)度：LPS組熒光強(qiáng)度增加，與空白組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；LPS+TRPV4抑制劑組熒光強(qiáng)度弱于LPS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果證明，骨性關(guān)節(jié)炎的炎癥環(huán)境在細(xì)胞層面上可能會導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流的強(qiáng)度變化。伴隨著TRPV4表達(dá)變化，相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-1、MMP-3及MMP-13存在變化。LPS組MMP-1、MMP-3及MMP-13較空白組升高；而LPS+TRPV4抑制劑組較LPS組表達(dá)降低。由此可知，KOA軟骨細(xì)胞中的TRPV4可能通過影響MMPs的表達(dá)水平參與軟骨降解的過程。

TRPV4通道最早是從大鼠的腎臟中分離出來的，并在軟骨、骨、滑膜等多種肌肉骨骼組織中廣泛表達(dá)，目前的研究主要聚焦于不同的傳入感覺神經(jīng)元，如傷害感受神經(jīng)纖維和背根神經(jīng)節(jié)[12]。KOCHUKOV等[13]證實，TRPV4在人類的滑膜細(xì)胞存在表達(dá)，并且該通道的功能表達(dá)可以被腫瘤壞死因子-α增強(qiáng)，因此將滑膜細(xì)胞的病理反應(yīng)與炎癥狀態(tài)聯(lián)系起來。本研究首先發(fā)現(xiàn)，TRPV4在人類KOA軟骨細(xì)胞中表達(dá)，同時，軟骨細(xì)胞在LPS，一種革蘭陰性菌細(xì)胞壁中的內(nèi)毒素，可引起炎癥。有證據(jù)表明LPS可能在關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用[14]，并被單獨或與膠原蛋白聯(lián)合應(yīng)用于關(guān)節(jié)炎模型的誘導(dǎo)刺激，TRPV4的表達(dá)隨LPS濃度和刺激時間的增加而增加。據(jù)此推測，TRPV4在KOA中的表達(dá)可能與炎癥程度的輕重有關(guān)。

與TRP家族的其他成員相比，TRPV4具有機(jī)械刺激激活的特點，被認(rèn)為是介導(dǎo)機(jī)械痛覺過敏的媒介。例如，在慢性壓迫大鼠背根神經(jīng)節(jié)后，TRPV4通道開放介導(dǎo)NF-κB信號通路的激活，并最終參與機(jī)械痛敏的形成[15]。眾所周知，NF-κB信號通路是參與KOA的主要信號通路之一，在MMPs的調(diào)控中起重要作用。TRPV4介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流激活細(xì)胞內(nèi)信號通路，對維持骨穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[16]。學(xué)者TORZILLI等[17]發(fā)現(xiàn)，在體外軟骨負(fù)荷模型中，機(jī)械負(fù)荷能增加MMPs的表達(dá)。上述研究提示，無論是機(jī)械刺激這樣的病理因素，還是軟骨降解破壞這樣的病理過程，TRPV4均與KOA十分契合。本實驗通過測量Ca2+內(nèi)流驗證KOA軟骨細(xì)胞TRPV4通道的功能性表達(dá)。結(jié)果顯示：空白組的熒光強(qiáng)度變化并不顯著；LPS組明顯增加；LPS+TRPV4抑制劑組稍有增加，但增加的強(qiáng)度弱于LPS組。該差異證明KOA軟骨細(xì)胞中存在著TRPV4的功能變化。

本研究試圖探討在KOA的炎癥環(huán)境中TRPV4的激活是否能調(diào)節(jié)MMPs的表達(dá)。MMPs是一族肽鏈內(nèi)切酶，能降解ECM中的多種底物。大量的研究表明，MMPs在關(guān)節(jié)軟骨破壞中起著關(guān)鍵作用。在各種MMPs中，MMP-1和MMP-13是膠原酶，MMP-3是基質(zhì)降解酶，MMP-1和MMP-13是導(dǎo)致膠原蛋白整體降解的主要因素。在本研究中，TRPV4的抑制可下調(diào)MMP-1、MMP-3及MMP-13的表達(dá)，提示KOA病程中TRPV4與MMPs有關(guān)，抑制TRPV4可能是抑制軟骨降解的有效方法。

本研究展示TRPV4通道在人類KOA軟骨細(xì)胞中的功能變化并參與調(diào)控MMP-1、MMP-3及MMP-13的表達(dá)，為KOA因生物力學(xué)因素導(dǎo)致軟骨破壞降解提供了新的解釋，為抑制KOA病程中軟骨破壞提供了新的靶點。盡管如此，本研究仍有不足。首先，實驗未能在動物模型上加以驗證；其次，TRPV4介導(dǎo)軟骨降解的具體機(jī)制缺乏探究。今后進(jìn)一步的研究將圍繞TRPV4通道開放后下游信號通路的傳導(dǎo)展開。