姚瑤，王宏宇，徐春

（1.錦州醫(yī)科大學(xué) 研究生學(xué)院，遼寧 錦州 121001，2.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學(xué)中心，北京 100039）

器官移植術(shù)后糖尿病是器官移植后常見(jiàn)的并發(fā)癥之一。研究提出器官移植術(shù)后糖尿病的發(fā)生與器官移植術(shù)后患者常用的免疫抑制劑他克莫司、環(huán)孢素有關(guān)，其中，他克莫司相較于環(huán)孢素更容易引起器官移植術(shù)后糖尿病[1]。他克莫司引起器官移植術(shù)后糖尿病的機(jī)制尚不清楚，有研究發(fā)現(xiàn)，他克莫司增加正常大鼠的血糖濃度具有時(shí)間及濃度依賴性[2]，尤其是與時(shí)間有關(guān)。有學(xué)者將他克莫司短期注入正常健康人體中，發(fā)現(xiàn)胰島素敏感性增加，同時(shí)對(duì)胰島素的分泌無(wú)影響[3]。SHIVASWAMY等[4]用他克莫司短期處理正常的大鼠，大鼠會(huì)出現(xiàn)高血糖，并伴有輕度的高胰島素血癥，即大鼠體內(nèi)有輕度的胰島素抵抗；用他克莫司長(zhǎng)期處理大鼠后，大鼠僅出現(xiàn)高血糖，未再出現(xiàn)高胰島素血癥，即大鼠已喪失胰島素分泌功能，該研究提示他克莫司引起糖代謝紊亂與時(shí)間有關(guān)。還有研究提出他克莫司具有促進(jìn)胰島細(xì)胞凋亡，抑制胰島素分泌，增加胰島素抵抗的作用[5]。目前，研究多集中于胰島B細(xì)胞，對(duì)胰島外的細(xì)胞（如肝臟細(xì)胞）研究較少。但筆者前期研究發(fā)現(xiàn)他克莫司能夠促進(jìn)肝細(xì)胞絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt的磷酸化，Akt的磷酸化能導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)代謝紊亂，提示他克莫司引起肝細(xì)胞中胰島素抵抗可能與胰島素信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白Akt的活化有關(guān)[6]。

2016年器官移植術(shù)后糖尿病診治指南指出，器官移植術(shù)后糖尿病與2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制方面存在某些交叉，因此在治療上與2型糖尿病類似。目前，二甲雙胍和DDP-4抑制劑可能是理想的首選藥物[7]。其中，DPP-4抑制劑是通過(guò)增加體內(nèi)胰高血糖素樣肽（glucagon-like peptide 1,GLP-1）濃度來(lái)降低血糖。GLP-1能從多方面降低血糖：延緩胃排空，增加飽腹感；促進(jìn)葡萄糖依賴性的胰島素分泌，抑制胰高血糖素的釋放；增加葡萄糖的利用，改善胰島素敏感性等。GLP-1對(duì)胰島及胰島外細(xì)胞均有作用，比如，在肝臟細(xì)胞中，GLP-1能促進(jìn)肝臟中糖原的合成，減少肝臟脂肪的累積[8]。因此可推測(cè)，GLP-1能改善他克莫司引起的肝臟脂質(zhì)的紊亂，該過(guò)程可能與Akt有關(guān)。GLP-1的主要活性成分為rhGLP-1（7-36），因此，本研究擬用rhGLP-1（7-36）聯(lián)合他克莫司共同作用于人正常肝細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)Akt的表達(dá)，證明GLP-1尚不能通過(guò)影響Akt蛋白來(lái)改善他克莫司引起的肝臟脂代謝紊亂。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物與試劑

rhGLP-1（7-36）購(gòu)自上海仁會(huì)生物制藥股份有限公司，人肝細(xì)胞系HL-7702細(xì)胞株購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞所，胎牛血清（fatal bovine serun,FBS）購(gòu)自杭州四季青生物工程有限公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自英國(guó)Gibco公司，他克莫司粉末、兔來(lái)源p-AktThr308單克隆抗體、兔來(lái)源p-AktSer473單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶（horse radish peroxidase,HRP）標(biāo)記抗鼠 /兔 IgG 購(gòu)自美國(guó) Cell Signaling Technology公司，鼠來(lái)源actin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，脫脂奶粉購(gòu)自上海碧迪醫(yī)療器械有限公司，其他常用試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純化。

1.2 儀器與設(shè)備

二氧化碳CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Forma公司），化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Aplegen公司），Synergy HT 酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Tek公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞分組及處理 培養(yǎng)人肝細(xì)胞系 HL7702細(xì)胞株至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按5×105個(gè)/ml均勻接種于60 mm培養(yǎng)皿上，隨機(jī)分為對(duì)照組、F組、G組、GF組。于37℃、5% CO2濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去舊培養(yǎng)基。F組用含5 mg/L他克莫司的10% FBS的RPMI 1640 培養(yǎng)基處理 90 min ；G 組用含 100 nmol/L rhGLP-1（7-36）的相同培養(yǎng)基處理90 min；GF組用含 5 mg/L 他克莫司和100 nmol/L rhGLP-1（7-36）的相同培養(yǎng)基處理90 min；對(duì)照組用等量的相同培養(yǎng)基處理相同時(shí)間。

1.3.2 Western blotting 檢測(cè) Akt蛋白的表達(dá)水平 各組細(xì)胞處理后，棄掉舊培養(yǎng)基，分別用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗2遍。每組細(xì)胞加入適量RIPA裂解液（內(nèi)含終濃度為1 mmol/L的苯甲基磺酰氟、氟化鈉、正釩酸鈉），4℃放置15 min。充分裂解后，收集裂解液至離心管中，16 000 r/min 離心 20 min。收集上清液，蛋白質(zhì)定量（BCA法）測(cè)定蛋白濃度并分裝。制備8%分離膠和5%濃縮膠（SDS-PAGE），等量蛋白與4×上樣緩沖液混合，沸水中加熱5 min至蛋白變性。蛋白上樣，電泳。再于100 V電壓下將蛋白轉(zhuǎn)至硝化纖維膜上。將膜用含5%脫脂奶粉的封閉液孵育3 h，用TBST（Tris-HCl緩沖鹽溶液加 Tween-20）洗 5 min，孵育一抗，4℃過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次5 min，室溫下孵育二抗1 h。再次用TBST洗膜3次，每次5 min。用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

人肝細(xì)胞系HL7702細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同處理組處理后，不同組中p-AktThr308蛋白的表達(dá)有差異（P＜0.05），進(jìn)一步與對(duì)照組比較，各實(shí)驗(yàn)組p-AktThr308蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05）（見(jiàn)圖1和表1）；不同組中p-AktSer473的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見(jiàn)圖2和表1）。

圖1 不同處理組p-AktThr308蛋白的表達(dá)

表1 不同處理組對(duì)Akt蛋白的影響 （±s）

表1 不同處理組對(duì)Akt蛋白的影響 （±s）

注：?與對(duì)照組比較，P ＜0.05。

組別 p-AktThr308 p-AktSer473對(duì)照組1.00±0.00 1.00±0.00 F組1.54±0.27? 1.22±0.13 G組1.73±0.31? 1.22±0.18 GF組1.91±0.46? 1.28±0.31 F值 6.521 1.648 P值 0.007 0.231

圖2 不同處理組p-AktSer473蛋白的表達(dá)

3 討論

絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt是蛋白激酶AGC家族中一員，與細(xì)胞的調(diào)節(jié)如細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活、增殖、凋亡、代謝及血管形成密切相關(guān)[9]。Akt的活化受到PI3Ks的調(diào)節(jié)，PI3Ks能產(chǎn)生脂類的第二信使PIP3。PIP3直接與Akt的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而將Akt征募至細(xì)胞膜上，使Akt活化。Akt的完全活化與Ser473及Thr308位點(diǎn)的磷酸化有關(guān)。本質(zhì)上來(lái)說(shuō)，Akt的活化是一個(gè)磷酸化與脫磷酸化的平衡過(guò)程。促進(jìn)Akt磷酸化的激酶主要有PDK1與mTORC2：PDK1的PH結(jié)構(gòu)域，直接與PIP3結(jié)合，使Thr308磷酸化，mTORC2能直接磷酸化Ser473。使Akt脫磷酸化的磷酸酶有以下幾種：脂類磷酸酶PTEN能使PIP3脫磷酸化，抑制Akt活性；PP2A酶、PHLPP1能使Akt脫磷酸化。而近年來(lái)發(fā)現(xiàn)他克莫司的結(jié)合蛋白——FKBP51能促進(jìn)PHLPP1與Akt結(jié)合使Akt脫磷酸化，提示他克莫司可能通過(guò)與FKBP51結(jié)合抑制Akt的脫磷酸化，提高細(xì)胞內(nèi)磷酸化Akt的水平[10]?；罨腁kt從胞膜轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，并且磷酸化其下游分子，在眾多下游分子中，與細(xì)胞代謝相關(guān)的蛋白主要包括：GSK3、FOXO1以及Akt亞基160[11]。其中，GSK3已被證實(shí)通過(guò)脂質(zhì)合成的關(guān)鍵因子SREBP調(diào)節(jié)脂肪的合成[12]。提示Akt能通過(guò)影響下游的GSK3來(lái)調(diào)節(jié)脂肪合成，與ONO等[13]肝臟中過(guò)表達(dá)Akt能引起肝臟脂肪變性及高甘油三脂血癥的研究相符合。本研究發(fā)現(xiàn)，他克莫司單獨(dú)作用于人正常肝臟細(xì)胞時(shí)能促進(jìn)Akt的磷酸化，提示他克莫司可能會(huì)因此引起肝臟脂質(zhì)代謝紊亂。

GLP-1是人體內(nèi)降低血糖的一種多肽。進(jìn)食后，受營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的刺激，胃腸道黏膜上的朗格漢斯細(xì)胞（L細(xì)胞）分泌GLP-1。GLP-1發(fā)揮降糖作用后，很快被DPP-4酶水解終止效應(yīng)。目前市面上以GLP-1為基礎(chǔ)的藥物包括GLP-1R激動(dòng)劑（艾塞那肽、利拉魯肽等），以及DPP-4酶抑制劑（西格列汀、沙格列汀、利格列汀、阿格列汀、維格列汀、吉格列汀）[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，這些藥物不僅能調(diào)節(jié)血糖，也能改善肝臟中胰島素抵抗[15-17]。TAHER等[18]發(fā)現(xiàn)在胰島素抵抗的小鼠模型中，艾塞那肽能抑制果糖喂養(yǎng)引起的血脂紊亂及肝臟極低密度脂蛋白的過(guò)度表達(dá)。盡管如此，GLP-1對(duì)肝臟脂肪代謝的機(jī)制仍不清楚，有學(xué)者提出GLP-1直接調(diào)節(jié)肝細(xì)胞內(nèi)的胰島素信號(hào)通路，降低肝臟脂肪變性[16]。肝臟脂肪合成的增加與異位脂質(zhì)的累積有關(guān)：肌肉中因異位脂質(zhì)累積，將已處理的糖傳遞給肝臟，導(dǎo)致肝臟的脂肪合成增加，引起高脂血癥，隨后巨噬細(xì)胞進(jìn)入脂肪組織引起脂肪分解，由于脂肪酸的脂酰化，能進(jìn)一步增加肝臟甘油三酯的合成，該過(guò)程大部分與肝臟中胰島素信號(hào)通路無(wú)關(guān)。本研究中用rhGLP-1（7-36）聯(lián)合他克莫司作用于人正常肝細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)Akt的磷酸化仍然升高，說(shuō)明GLP-1改善他克莫司引起的肝細(xì)胞脂質(zhì)紊亂與Akt蛋白無(wú)關(guān)，其可能通過(guò)影響其他蛋白來(lái)降低肝臟脂質(zhì)的累積。本研究?jī)H研究GLP-1對(duì)他克莫司短期作用的影響，且只研究Akt蛋白，因此還需繼續(xù)研究他克莫司長(zhǎng)時(shí)間作用于肝細(xì)胞后，GLP-1是否能通過(guò)Akt改善他克莫司引起肝臟脂肪代謝的紊亂；并繼續(xù)研究胰島素信號(hào)通路中的其他蛋白，進(jìn)一步確定GLP-1能否通過(guò)胰島素信號(hào)通路改善他克莫司引起的肝脂質(zhì)紊亂。