張黎明，黃孝天

（南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)部微生物學(xué)教研室，江西南昌 330006）

1 脂肪酶的蛋白結(jié)構(gòu)和功能

1.1 脂肪酶的分子結(jié)構(gòu)

白色念珠菌脂肪酶（Lipase，EC3.1.1.3，甘油酯水解酶）是細(xì)胞外水解酶，分泌24 h后在37 ℃、pH為7的環(huán)境中具有最大活性[1]。從結(jié)構(gòu)上講，脂肪酶呈現(xiàn)α/β水解酶的典型折疊，由8個β折疊（β1～β8）形成的中央結(jié)構(gòu)和6個α螺旋（αA～αF）相互連接。脂肪酶的活動中心由3種氨基酸組成：絲氨酸，天冬氨酸或谷氨酸和組氨酸，屬于絲氨酸蛋白酶類。在水性介質(zhì)中，大多數(shù)脂肪酶通過水/脂質(zhì)界面發(fā)揮作用，稱為界面活化現(xiàn)象。催化部位包埋在分子中，表面被α-螺旋環(huán)肽覆蓋形成螺旋蓋狀的覆蓋，起保護作用，是兩親性結(jié)構(gòu)，“蓋子”的外表面相對親水，內(nèi)表面則相對疏水。由于脂肪酶與油-水界面的締合作用，導(dǎo)致“蓋子”張開，活性部位暴露，使底物與脂肪酶結(jié)合能力增強，底物較容易地進入疏水性通道而與活性部位結(jié)合生成酶-底物復(fù)合物。“蓋子”的兩親性質(zhì)及其特定的氨基酸序列對于脂肪酶的活性和特異性也可能是重要的[2-4]。

1.2 脂肪酶的功能

脂肪酶的催化機理基于4個階段組成的負(fù)載交換系統(tǒng)。在底物結(jié)合后，絲氨酸的羥基在脂質(zhì)酯鍵上發(fā)生親核攻擊，導(dǎo)致鍵的斷裂并在脂肪酸和親核絲氨酸之間形成中間體。然后，釋放出醇，水分子攻擊過渡中間體的酯鍵，從而產(chǎn)生第二次親核攻擊，導(dǎo)致脂肪酸的釋放和催化中心的再生[4]。該催化過程具有雙重功能，不僅會生成重要的分子作為真菌生存的營養(yǎng)來源，而且可以對細(xì)胞壁和組織造成破壞，在宿主入侵中也起著關(guān)鍵作用[5-7]。

2 白色念珠菌脂肪酶的編碼基因及其表達(dá)

2.1 白色念珠菌脂肪酶的編碼基因

WernerH[8]首先描述了念珠菌致病菌株中的脂肪酶活性。1997年，F(xiàn)uY等[9]分離出白色念珠菌中第一個克隆的脂肪酶基因，名為Lip1。2000年，Hube等[10]報道了該脂肪酶基因家族（Lip2～Lip10）9個新成員的存在，這些成員已被克隆和鑒定，與脂肪酶基因Lip1有很高的相似之處。10個脂肪酶基因的開放閱讀框都在1 281～1 416 bp，蛋白質(zhì)編碼高度相似，氨基酸序列達(dá)到80%相同。Lip蛋白具有4個保守的半胱氨酸殘基，保守的N-糖基化位點和類似的疏水性。除了LIP7，所有LIP都具有編碼N-末端的信號序列。

白色念珠菌脂肪酶基因存在于4種不同的染色體上：1、6、7和R。根據(jù)其在氨基酸水平上的同源性，可以將脂肪酶同工酶分為3個亞群。第一亞群由Lip1、Lip2、Lip3、Lip6和Lip10組成，顯示出至少74%的相似性。第二亞群由具有至少68%相似性的脂肪酶Lip4、Lip5、Lip8和Lip9組成。第一亞群的成員在1號染色體上編碼，而第二亞群的成員除了位于6號染色體的Lip4外，其他都位于7號染色體上。Lip7與其他脂肪酶成員之間差異最大，不編碼任何信號肽，并且是唯一存在于R染色體上編碼的基因。這種廣泛的染色體重排使真菌能夠應(yīng)對不同的條件，這表明脂肪酶基因家族的表達(dá)是白色念珠菌適應(yīng)其宿主的機制[11]。

2.2 白色念珠脂肪酶基因差異表達(dá)

白色念珠菌的10個脂肪酶基因，在實驗?zāi)Ｐ秃突颊邩悠分械亩ㄖ尺^程中存在差異表達(dá)，并且受感染階段和感染部位的影響很大[12]。用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)研究了這一多基因家族在實驗感染和口腔念珠菌病患者樣本中的表達(dá)模式。研究結(jié)果表明，在系統(tǒng)性念珠菌病小鼠模型中，個別脂肪酶基因受到不同程度的調(diào)控，一些成員表現(xiàn)出持續(xù)表達(dá)，而另一些成員則表現(xiàn)出短暫表達(dá)甚至沉默。脂肪酶基因表達(dá)譜與感染階段有關(guān)，而與器官定位無關(guān)。在口腔念珠菌病的實驗?zāi)Ｐ椭幸矙z測到脂肪酶基因表達(dá)的這種時間調(diào)節(jié)，對8名鵝口瘡患者的研究也顯示了差異表達(dá)，在所有樣品中均表達(dá)了Lip1和Lip9，表明與定居場所相關(guān)，未檢測到Lip10，并且在50%的樣品中檢測到Lip4、Lip5和Lip8轉(zhuǎn)錄本[13]。采用小鼠消化道定植（盲腸內(nèi)容物）和口胃感染黏膜念珠菌病模型，研究了白念珠菌脂肪酶基因家族（Lip1～Lip10）的表達(dá)。在制備的盲腸內(nèi)容物和受感染粘膜組織（胃、硬腭、食道和舌頭）樣本中幾乎每個都表達(dá)Lip4～Lip8，這表明這些基因產(chǎn)物具有維持功能。相比之下，在受感染的胃組織中一致檢測到的Lip1、Lip3和Lip9在受感染的口腔組織中基本上是檢測不到的。此外，Lip2在盲腸內(nèi)容物中表達(dá)一致，但在受感染的口腔組織中檢測不到，表明Lip2可能對消化道定植很重要，但對口腔感染不重要[14]。

3 白色念珠菌脂肪酶的致病性

3.1 為白色念珠菌提供營養(yǎng)

突變株（ΔLip8/ΔLip8）ΔLip8/ΔLip8的白色念珠菌在含脂培養(yǎng)基YNB-Tween40和一種用于腸道外營養(yǎng)治療的含脂質(zhì)溶液中，生長能力均顯著降低，說明脂肪酶可能在消化脂質(zhì)以獲取營養(yǎng)方面起著重要作用[15]。這在全腸外營養(yǎng)環(huán)境中尤其重要，特別是在脂肪注射的情況下，脂肪酶的產(chǎn)生將促進白念珠菌獲取營養(yǎng)[16]。

3.2 對宿主細(xì)胞的損傷作用

Maria等[17]利用白色念珠菌釋放的細(xì)胞外脂肪酶直接與單核細(xì)胞作用，分別用25 U和100 U的脂肪酶作用單核細(xì)胞，并在6 h、12 h、18 h、24 h、48 h和72 h監(jiān)測細(xì)胞損傷，發(fā)現(xiàn)脂肪酶對正常單核細(xì)胞的作用取決于孵育時間和劑量。高劑量的脂肪酶能夠誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)的LDH(乳酸脫氫酶)釋放和核形態(tài)的嚴(yán)重變化，從而支持真菌脂肪酶直接與這種哺乳動物細(xì)胞相互作用并產(chǎn)生損害。Gácser等[18]構(gòu)建了近平滑念珠菌CpLip1和CpLip2的敲除突變體，并評估了這些脂肪酶在真菌病發(fā)病機理中的作用。這些脂肪酶參與內(nèi)皮細(xì)胞和人口腔上皮中LDH的釋放和細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)，表明這些酶也參與宿主細(xì)胞的損傷。與兩種巨噬細(xì)胞（J774.16和RAW264.7Mf）共培養(yǎng)后，兩種巨噬細(xì)胞均能有效殺死近平滑念珠菌，然而與野生型相比，脂酶陰性細(xì)胞的殺滅率更高。Paraje等[17,19]使用來自白色念珠菌的純化脂肪酶，提供了有關(guān)該脂肪酶對免疫系統(tǒng)細(xì)胞和宿主實質(zhì)細(xì)胞直接作用的重要證據(jù)，并報道了這種脂肪酶具有誘導(dǎo)高濃度有氧化合物產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡的能力。在使用白色念珠菌突變體ΔLip8/ΔLip8感染的念珠菌病小鼠模型中，與親本菌株感染相比，腎臟感染數(shù)量低于親本菌，這清楚地表明Lip8是感染的關(guān)鍵毒力因子[15]。

Graciela等的研究表明全身性白色念珠菌感染會導(dǎo)致肝臟細(xì)胞脂肪變性[20]。該研究報道了一個有趣的結(jié)果：對應(yīng)于脂肪儲存的單核細(xì)胞中，細(xì)胞質(zhì)強烈空泡化，在更長的孵育時間和更高的脂肪酶劑量下都增加了細(xì)胞的空泡變性。脂質(zhì)積累是真核病原體細(xì)胞中脂肪酶的生理功能。在對肝細(xì)胞的體外實驗中，脂肪酶就具有直接損傷肝細(xì)胞并誘導(dǎo)脂肪沉積的能力，真菌代謝物與白色念珠菌的同時孵育產(chǎn)生加和效應(yīng)，在與白色念珠菌進行長時間培養(yǎng)（12 h）后，才能看到少量的脂肪堆積，而滅活的白色念珠菌則不會產(chǎn)生這種現(xiàn)象。這些結(jié)果證明了這種真菌因子具有誘導(dǎo)體外脂肪變性的能力[17]。

Castillo等[21]評估了分離自口腔損傷患者的念珠菌病原菌中脂肪酶的活性，結(jié)果為非典型扁平苔蘚、惡性病變（鱗狀細(xì)胞口腔癌）、慢性念珠菌病和健康的粘膜。所有病變的臨床分離株均具有脂肪酶活性，但未檢測到健康對照組的脂肪酶活性。與從其他口腔病變中分離出的分離物相比，口腔癌分離物顯示出更高的脂肪酶活性，表明具有更大的致病潛力。

4 白色念珠菌脂肪酶作為潛在的藥物靶點

以念珠菌脂肪酶為藥物作用靶點的抗真菌治療仍然是一個挑戰(zhàn)。目前條件致病真菌，尤其是白色念珠菌感染引起的疾病增加，而抗真菌藥物種類少且耐藥能力的增強對臨床治療提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[22]。在體外感染模型中，使用了重構(gòu)的人體組織模型來模擬白色念珠菌和近平滑念珠菌感染，ASA（阿司匹林）的治療濃度降低了組織損傷。在富含橄欖油的脂質(zhì)基本培養(yǎng)基中，白色念珠菌、近平滑念珠菌和近平滑念珠菌脂肪酶陰性（ΔcpLip1-2/ΔcpLip1-2）突變體的生長，進一步評估了ASA的脂肪酶抑制作用，發(fā)現(xiàn)治療濃度的ASA抑制了野生型真菌的生長。脂肪酶抑制劑奎寧和依貝內(nèi)酯B抑制念珠菌的生長，減少了念珠菌對組織的損傷[23]。

5 結(jié)語

白色念珠菌脂肪酶在白色念珠菌侵入和致病過程中起到重要作用，但致病的機制研究較少，未來還需要從以下3個方向進行研究：（1）探究脂肪酶分泌到細(xì)胞外是通過囊泡還是其他途徑；（2）開發(fā)出新的抑制脂肪酶分泌的藥物來治療真菌感染；（3）探究通過特異性脂肪酶鑒定白色念珠菌感染的可行性。