魯吉珂,陳 培,曹娜娜,陳 晨,伊娟娟,郝利民

（1.鄭州大學生命科學學院,河南 鄭州 450001；2.軍事科學院軍需工程技術研究所,北京 100010）

電離輻射是能引起物質電離的輻射總稱,可以通過直接或間接作用電離出物質中的原子和分子[1-2]。隨著核能的發(fā)展和核技術在能源和醫(yī)療等領域的廣泛應用,電離輻射幾乎無處不在,如果使用或控制不當,可對人類健康帶來潛在的危害與風險。電離輻射對生物體的損害表現(xiàn)為生物體內重要器官損傷以及相關調控系統(tǒng)紊亂[3-4],這也會導致機體造血功能、生殖系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)等不同程度的損傷[5-6],甚至發(fā)生癌變[7],其損傷程度取決于輻射種類、劑量、時間及機體的敏感性[8]。

電離輻射主要來源于宇宙射線、環(huán)境中天然放射性核素和核能應用中的人工電離輻射源等,其中人工電離輻射源在工業(yè)、醫(yī)學診療以及軍事作業(yè)中應用非常廣泛,是輻射防護研究的重點[9]。在臨床上放射治療是利用電離輻射抑制或殺滅癌細胞的一種有效手段[10-12],已廣泛應用于多種癌癥的治療[13-16],但對正常細胞的輻射損傷仍是限制其有效利用的關鍵因素。另一方面,輻射暴露人員長期在核輻射條件下工作和生活,易遭受低劑量慢性輻射。因此,如何有效防護這種慢性輻射,保障人員身體健康,具有重要的軍事價值和社會意義。

為了減少輻射對正常細胞及組織的不利影響,人們采取多種防護措施以保障作業(yè)人員的健康,如縮短輻射暴露時間、增大接觸距離、加強輻射屏蔽、積極使用個人防護裝備等[17]。美軍曾為作戰(zhàn)人員配發(fā)核輻射防護裝備,并開展了相應的防護訓練,而開發(fā)輻射防護劑是減輕人體電離輻射損傷的有效便捷手段之一。

輻射防護劑是應用于輻照前后來保護機體免受輻射損傷的一類功能性制劑[18],其研究開發(fā)已成為當今醫(yī)療衛(wèi)生、軍事、能源等領域關注的焦點之一。目前,已經(jīng)開發(fā)的輻射防護制劑以藥物為主,如含硫化合物、細胞因子和激素等[8],但其成本較高,且有一定毒副作用,常用于高劑量急性放射病治療。與之相比,富含天然輻射防護功能因子的功能食品通過飲食調理提高機體輻射耐受性,對于長期低劑量慢性輻射在效用和成本上具有特殊的優(yōu)勢。功能食品是供特定人群使用,不以治療疾病為目的,并且具有調節(jié)機體生理機能,有助于改善健康狀況或減少疾病發(fā)生的一類特殊食品。從天然產(chǎn)物或微生物代謝物中篩選制備具有電離輻射防護作用的功能食品基料,開發(fā)輻射防護功能食品,通過飲食調理提高機體輻射耐受性或降低輻射對機體的損害,是輻射防護的一條重要途徑。目前已經(jīng)報道的天然輻射防護劑,如黃酮類、多糖類、多酚類以及皂苷類等功能因子[19],能夠通過清除自由基,促進DNA修復并調節(jié)凋亡信號通路,以減少輻射對人體造成的造血系統(tǒng)、消化系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)的損傷[20-23],其作用時效長,成本低且無明顯毒副作用[24-25]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate,EGCG）是綠茶中含量最高、活性最強的多酚類化合物,具有抗氧化、清除自由基和輻射防護等多種活性,以EGCG為主要組分的綠茶源食品一直是輻射防護食品開發(fā)的熱點[26-27]。

1 miRNAs、表觀遺傳和食品

1.1 miRNAs與表觀遺傳

MicroRNAs（miRNAs）是真核生物中廣泛存在的一類調控基因表達的內源性非編碼RNA,其大小約為20～25 個核苷酸[28-29]。miRNAs主要通過堿基配對的方式與靶基因mRNA特異結合[30-31],從而調控轉錄后基因表達[32]。在人類等哺乳動物中至少有1/3的基因受miRNAs調控,單個miRNA可調控數(shù)十個基因[33]。miRNAs在基因轉錄和轉錄后加工、細胞分化和個體發(fā)育、遺傳和表觀遺傳等幾乎所有的重要生命活動中發(fā)揮重要作用,對miRNAs的鑒定及功能探索已成為當前生命科學研究的熱點和前沿。

表觀遺傳學是在不改變DNA序列的情況下,生物表現(xiàn)型發(fā)生改變,并保持相對穩(wěn)定和遺傳[34]。表觀遺傳學研究表明,環(huán)境在生物表型改變中發(fā)揮重要作用,而電離輻射是一種重要的環(huán)境因子,也是表觀遺傳學研究的重要模型。近年來研究證實,表觀遺傳和miRNAs間存在著一定的聯(lián)系,不僅miRNAs的表達受表觀遺傳學調控,而且miRNAs也可通過調節(jié)DNA甲基化或組蛋白修飾等途徑影響表觀遺傳[35]。

1.2 miRNAs與食品

食品攝入是生物體與外界進行物質、能量和信息交換的一種方式,特定的飲食和功能食品因子會影響miRNAs的表達。體外癌細胞實驗證實,功能食品因子可以調控miRNAs表達,從而發(fā)揮抑癌作用。目前,研究較多的功能食品因子主要為多酚類物質,如EGCG、姜黃素和異黃酮等[36]。Tsang等[37]采用miRNAs芯片技術,對EGCG處理前后的人肝癌細胞中miRNAs差異表達進行分析,其中13 條miRNAs表達上調,48 條miRNAs表達下調,并證實EGCG可通過上調miR-16誘導人肝癌細胞細胞凋亡。Sun等[38]對姜黃素處理人胰腺癌細胞的效果進行了研究,結果顯示姜黃素可通過上調miR-22和下調miR-199a抑制胰腺癌細胞增殖,其也可通過下調miR-186表達促進人肺腺癌細胞凋亡[39]。Li Yiwei等[40]采用異黃酮處理胰腺癌細胞,可使miR-146a表達明顯上調,從而抑制胰腺癌細胞轉移。

和體外細胞實驗類似,動物實驗和人體實驗也證實特定的飲食可調控miRNAs表達。Tryndyak等[41]以大鼠為對象的研究發(fā)現(xiàn),甲基不足的飲食可誘導肝癌的發(fā)生,同時也可誘導大鼠肝臟中miRNAs表達的顯著變化,包括miR-34a、miR-127、miR-200b和miR-16a。Cirera等[42]對一種哥廷根小型豬喂食高膽固醇飲食,并采用標準飲食作對照,結果高膽固醇組的體質量、總膽固醇和高密度脂蛋白含量均顯著增高,而肝臟miR-122表達顯著降低。人體實驗證實,在葉酸缺陷的飲食條件下,miR-222表達顯著增強,并且低葉酸吸收水平時人外周血中miRNAs表達水平可反映其營養(yǎng)狀況[43]。

1.3 食品與表觀遺傳

食品和功能食品因子對生物體和細胞的作用不僅局限于生物表型及miRNAs表達差異,更為重要的是,表觀遺傳學研究表明,作為遺傳與環(huán)境重要接口的食品,其對生物體的影響可能會傳遞至后一代甚至后幾代。Sen等[44]研究發(fā)現(xiàn),孕期母親肥胖可顯著增加子代大鼠出生后肥胖的風險,而采用富含VA、VC、VE等抗氧化劑的高脂飲食喂飼雌性大鼠,與高脂飲食雌性大鼠對照組相比,子代大鼠的肥胖傾向顯著降低,表明抗氧化食品對生物體氧化應激的調節(jié)具有傳代作用。Zhang Junlong等[45]研究證實,雌性小鼠孕期和哺乳期高脂飲食對子代有長效影響,子代小鼠miRNAs表達發(fā)生顯著變化,有23 條miRNAs表達水平下調了1.5～4.9 倍,下調miRNAs主要有miR-709、miR-122、miR-192、miR-194、miR-26a、let-7a、let-7b、let-7c、miR-494和miR-483。類似地,雌性小鼠孕期和哺乳期高脂飲食可下調子代小鼠miR-122、上調miR-370表達,通過調控miRNA和相關基因的表達影響子代早期脂代謝[46]。不僅如此,母親孕期飲食對子代影響具有性別特異性,Mao Jiude等[47]對孕期小鼠分別采用差異化含脂飲食,在孕期12.5 d提取胎盤RNA進行分析,發(fā)現(xiàn)飲食誘導基因差異表達具有性別特異性,營養(yǎng)變化時雌性胎盤基因表達差異比雄性胎盤更為敏感。

食品對后代的影響不僅來自于母親,也來自于父親。Ng等[48]的研究發(fā)現(xiàn),采用高脂飲食的雄性小鼠,在追蹤其雌性后代的健康時,父代的高脂飲食會導致雌性子代β細胞功能紊亂,削弱子代葡萄糖和胰島素的平衡從而引起代謝疾病。除此之外,Carone等[49]的研究顯示,攝入低蛋白食物的雄性小鼠的子代,其肝臟中脂肪和膽固醇表達基因較多,心臟病的發(fā)病率增加,表明父代飲食會影響子代脂肪和膽固醇代謝途徑。

2 miRNAs與電離輻射

1993 年Ambros Victor博士首次在秀麗隱桿線蟲體內發(fā)現(xiàn)miRNA,現(xiàn)已證實miRNAs作為調控分子參與了幾乎所有的生物學過程[50],在細胞增殖、分化、凋亡過程中占據(jù)著重要的生物學地位[51]。腫瘤學研究表明,miRNAs功能失調與多種惡性腫瘤密切相關[32],不同腫瘤對應的miRNAs可發(fā)揮致癌基因或抑癌基因的作用[52]。電離輻射是多種腫瘤尤其是白血病和淋巴癌的重要致癌因素,但其致癌機制目前尚不清楚。輻射誘導小鼠胸腺淋巴瘤模型表明,輻射致癌是一個多因素調節(jié)的多步驟復雜過程,包括致癌基因Ras、抑癌基因PTEN和抑癌基因p53,基因調控分子miRNAs也發(fā)揮重要作用[53]。Liu Cong等[53]對miRNAs在輻射致癌中的作用進行了探究,采用輻射誘導的小鼠淋巴瘤模型,結果顯示輻射致癌胸腺組織中miR-21表達上調、抑癌基因Big-h3表達下調,miR-21可以特異性靶向小鼠抑癌基因Big-h3并抑制其表達。Josson等[54]對miRNAs在前列腺癌細胞輻射處理中的調控作用進行了研究,篩選出兩條顯著差異表達的miRNAs、miR-521和miR-34c,結果表明miRNAs可通過調控DNA修復蛋白的表達,提高前列腺癌細胞的輻射敏感性。不僅如此,miRNA的表達也會影響電離輻射敏感性。miR-101的過表達抑制了鼻咽癌細胞增殖,增強了鼻咽癌細胞的放射敏感性[55],miR-15a/16通過靶向TLR1/NF-κB信號增強了非小細胞肺癌細胞的輻射敏感性[56]。另外,miR-30在小鼠血清中以輻射劑量依賴性方式上調,在輻射誘導的凋亡中起關鍵作用[57]。由此可見,miRNAs在正常細胞和癌細胞的輻射處理過程中發(fā)揮重要作用。

本課題組前期通過高通量測序技術對4 Gy60Coγ輻射后小鼠組織中差異表達miRNAs進行篩選,結果表明在小鼠胸腺中共發(fā)現(xiàn)112 個差異表達的miRNAs（45 個已知miRNAs及67 個新的miRNAs）[58]；同時,在小鼠肝臟中共發(fā)現(xiàn)48 個差異表達的miRNAs（27 個已知miRNAs及21 個新的miRNAs）[59]；其中miR-34a顯著上調,這與文獻[59]報道結果一致。近年來,miR-34a與輻射的關系備受關注[60-61]。在正常細胞和癌細胞中,輻射可上調miR-34a并通過調節(jié)下游分子機制誘導凋亡[62-63]。甚至有研究表明,miR-34a可作為機體輻射損傷標志物[64-65]。因此,miR-34a可能是探索輻射防護作用機制的一個重要調控分子。

3 電離輻射與miR-34a信號通路

沉默信息調節(jié)因子（silent information regulator 1,Sirt1）是已經(jīng)證實的miR-34a靶基因之一[66-67],在生物學過程中發(fā)揮重要作用[68-70]。有研究表明,一氧化碳可以通過抑制miR-34a的表達,從而促進Sirt1的表達來保護肝臟免受缺血、灌注損傷[71]。Sirt1可通過去乙?；^程調控其下游基因,如腫瘤抑制基因p53。Sirt1可使p53第382 位賴氨酸殘基去乙?；种苝53活化[72-73]。而p53是核轉錄因子,在發(fā)生DNA損傷、活性氧、癌基因激活與缺氧等遺傳毒性應激反應時,其可通過調控下游基因引起細胞周期阻滯,影響DNA修復、誘導細胞調亡[74-75]。p53可與miR-34a的CpG島啟動子區(qū)域發(fā)生去甲基化反應,激活miR-34a的表達,從而調控細胞增殖與凋亡[76-78]。因此,miR-34a、Sirt1、p53三者形成一個反饋調節(jié)回路,參與細胞增殖和凋亡的調控,這對于電離輻射防護調控機制研究非常重要。

由于miR-34a/Sirt1/p53信號通路與細胞凋亡密切相關,因此凋亡相關蛋白對于研究輻射防護調控機制也非常重要。目前研究比較清楚的執(zhí)行細胞凋亡的基因家族Bcl-2是由抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax組成,構成了細胞死亡通路關鍵決定調控點。在細胞中,Bax被Bcl-2功能屏蔽。若Bax被活化,將發(fā)生一系列的構象變化,使線粒體膜滲透性發(fā)生改變,促進細胞色素c等促凋亡分子的分泌[79]。Caspase是凋亡通路的下游相關蛋白,而Caspase-3是Caspase家族中負責降解細胞基質的重要效應器。在應激條件下,線粒體中釋放的細胞色素c激活Caspase-3,清除各種細胞基質,導致出現(xiàn)凋亡的形態(tài)特征,形成凋亡小體[80-81]。另外,Bcl-2家族被證實是p53作用的靶點之一,p53可調控抗凋亡蛋白Bcl-2的轉錄來抑制其功能,p53還可以與促凋亡蛋白Bax的啟動子結合,激活線粒體介導的凋亡途徑。因此,miR-34a/Sirt1/p53信號通路及凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3在細胞增殖與凋亡中發(fā)揮重要作用,其對于研究輻射防護作用機制具有重要意義。

本課題組在體外研究中發(fā)現(xiàn),60Coγ輻射可激活正常肝細胞AML-12內miR-34a/Sirt1/p53信號通路,上調miR-34a,下調抗凋亡蛋白Bcl-2,上調促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達,最終導致細胞發(fā)生氧化損傷。采用功能食品因子EGCG預處理,可抑制miR-34a/Sirt1/p53信號通路,下調miR-34a,上調Bcl-2,下調Bax和Caspase-3的表達,進而發(fā)揮輻射防護功能[26]。因此,這個信號通路與天然產(chǎn)物的抗輻射機制密切相關。其后,本課題組又從免疫調節(jié)作用和抗氧化活性兩個方面對EGCG的體內輻射防護作用進行了研究,結果發(fā)現(xiàn)電離輻射能夠打破機體內氧化還原系統(tǒng)平衡,進而對小鼠正常組織造成嚴重損傷,采用EGCG灌胃30 d可以通過調節(jié)小鼠免疫活性及抗氧化活性而有效減輕輻射對小鼠脾臟及肝臟組織的損傷[27]。因此,EGCG是改善電離輻射損傷的一種有效的天然輻射防護劑,多酚類抗氧化劑具有良好的電離輻射防護功能。

4 結 語

輻射防護功能食品的開發(fā)與應用,是保護電離輻射損傷的一條有效新途徑。在輻射環(huán)境、生物體和食品這三者的相互關系中,miRNAs作為調控分子可能發(fā)揮重要作用。生物體處于輻射應激環(huán)境其miRNAs表達會發(fā)生變化,而攝入功能食品不僅可調控miRNAs表達,而且這種調控可能具有傳代作用。miR-34a在電離輻射損傷和防護中發(fā)揮重要作用,電離輻射、輻射防護功能食品和miR-34a/Sirt1/p53信號通路密切相關。未來可進一步探究天然產(chǎn)物的作用靶點,并繼續(xù)對功能食品與環(huán)境因素相關的表觀遺傳學問題進行深入研究。