張夢瑤，楊 峰，劉開東，劉積鳳，柳 楠，賀建寧，薛 明

(1.青島農業(yè)大學 動物科技學院，山東 青島 266109；2.青島畜牧獸醫(yī)研究所，山東 青島 266121；3.內蒙古農業(yè)大學， 內蒙古 呼和浩特 010018；4.全國畜牧總站，北京 100125)

敖漢細毛羊是我國非常典型的一種細毛羊，它主要集中分布在我國的東北部一些地區(qū)。論羊毛品質，與其他羊的羊毛相比存在著相當大的優(yōu)勢[1]。毛囊的生長發(fā)育后期形成羊的被毛，對于羊毛的產量也是由毛囊的組織結構來控制的[2]。羊毛的粗細、生產量以及形狀的變化離不開對毛囊的發(fā)育規(guī)律和結構特征的研究[3]?，F(xiàn)在對成年綿羊以及出生后綿羊的毛囊研究已經相當成熟，Stenn等[4]在成年綿羊身上對毛囊的生長變化進行了研究，得到毛囊的生長呈現(xiàn)出周期性。柳楠等[5]在對敖漢細毛羊不同發(fā)育時期對毛囊生長發(fā)育的變化進行了研究，同時也對羊毛的粗細、長短等相關方面進行了研究。目前，對羊毛的研究主要聚焦在通過毛囊的發(fā)育來研究對羊毛的生成影響，很少通過研究控制這些性狀的主要通路以及關鍵基因的作用，因此對基因以及通路的研究顯得尤為重要。

BMPs蛋白具有分泌功能，不僅能使軟骨和骨形態(tài)發(fā)生變化[6-7]，還能夠調控胚胎的發(fā)育，尤其是在皮膚附屬物的形成和分化中均發(fā)揮了重要的作用[7]。許多研究報道，BMPs可以在多個組織器官中進行表達，有生殖器官像卵巢、前列腺等，還有皮膚及其衍生物等。尤其重要的是，BMPs可以對毛囊的發(fā)育進行調控，在調控的信號通路中每個信號分子都有著各自的不同，有些信號分子對毛囊表現(xiàn)出抑制作用有些則表現(xiàn)出促進作用[8-10]。前人對BMP4也有過相關的研究，毛青青等[11]通過小鼠的體內代謝對BMP4基因調控研究，從而初步的推斷出BMP4是皮膚和毛囊發(fā)育中一個比較關鍵性的基因。依據(jù)信號通路的分類，BMP4也是TGF-β信號通路中的承前啟后的關鍵基因[11]，BMP4不僅促進smad5的表達同時也可以反作用于TGF通路中某些基因的表達，BMP4不僅僅是在BMP信號通路中進行調控相對應的上下游信號分子，還在TGF通路中控制調節(jié)一些信號，對生殖發(fā)育、細胞增殖、分化等起到關鍵性作用[7-12]，因此研究此基因顯得尤為重要。

目前，對BMP4基因與皮膚毛囊關系的研究主要集中在絨山羊和小鼠身上，且研究主要集中在分子水平上，還有一些是與皮膚毛囊無關的研究，像骨的調節(jié)、繁殖等，還未發(fā)現(xiàn)在細胞水平上來驗證BMP4的功能。所以本研究通過對真核表達載體的構建以及轉染成纖維細胞對BMP4基因的表達進行分析。結果顯示，質粒構建成功且BMP4基因轉染成纖維細胞后過表達?？蔀橐院蟾顚哟蔚难芯刻峁﹫詫嵉幕A。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選取健康敖漢細毛羊的30日齡胎羊(由青島畜牧所奧特種羊場提供)。

1.2 試劑及儀器

pcDNA3.1質粒、EcoRⅠ、KpnⅠ限制性內切酶等均購自青島鑫宇恒一科技有限公司。Redbio CFX ConnectTM熒光定量PCR等均購自Bio-Rad[13]。

1.3 真核表達載體構建

1.3.1 設計引物 參考綿羊BMP4基因組(GenBank登錄號為NM-001110277.1)CDS區(qū)序列進行上下游引物的設計，同時在上下游引物的5′端處加上EcoRⅠ、KpnⅠ酶切位點[13]。

上游引物：5′-CCGAATTTGGAAGTCCTAAAT GATCCTG-3′；下游引物：5′-CGGGGTACCGGCATCA GCCATCCCACATTC-3′。進行PCR擴增獲得目的片段，擴增體系為：25 μL，分別為：cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，GreeMix 23 μL。

1.3.2 T克隆 PCR擴增結束之后對目的片段進行膠回收，后與pGM-T載體進行連接，連接體系：T4DNA連接酶2 μL；T4DNA連接酶Buffer 1 μL；pGM-T載體2 μL；目的片段5 μL；具體步驟見pGM-T克隆試劑盒。將pGM-T連接液轉化DH5ɑ感受態(tài)細胞，搖菌，培養(yǎng)12 h后送生工公司測序[13-14]。

1.3.3BMP4基因與pcDNA3.1連接 對重組pGM-T-BMP4及pcDNA3.1這2個載體均進行EcoR Ⅰ、KpnⅠ雙酶切，酶切體系：EcoR Ⅰ1 μL；KpnⅠ1 μL；pGM-T-BMP4和pcDNA3.1 各4 μL；Buffer 1 μL ddH2O 39 μL；利用切膠回收試劑盒對BMP4基因和pcDNA3.1進行膠回收，回收以后對BMP4基因和pcDNA3.1進行連接，其體系：BMP45 μL，pcDNA3.1 3 μL，T4DNA 1 μL、Buffer 1 μL，混勻后在22 ℃金屬浴中加熱2 h，再到16 ℃加熱 3 h，后再進行轉化搖菌，對獲得的菌液利用PCR進行鑒定，對陽性組進行測序準確鑒定[13]，并利用OZNA質粒提取試劑盒提取重組質粒[13-14]。

1.4 敖漢細毛羊成纖維細胞培養(yǎng)

取30日齡胎羊只留軀干將其處理成1.0～1.5 mm3大小，滴利用胎牛血清進行培養(yǎng)(37 ℃，5.0% CO2)。24 h后需要換培養(yǎng)液，并對細胞的形態(tài)進行觀察。當細胞密度大約在95%時需要對細胞進行傳代培養(yǎng)，按照1∶3比例進行，傳代后繼續(xù)對細胞進行培養(yǎng)等待后續(xù)的傳代[14-15]。

1.5 細胞瞬時轉染

用Lipofectamine2000對細胞進行瞬時轉染，需要脂質體20 μL，不含雙抗的培養(yǎng)液480 μL，超凈臺內放置5 min對脂質體進行孵育。后進行轉染，轉染的體系為pcDNA3.1-BMP440 μL，DMEM(不含雙抗)460 μL，對照組中不含重組表達載體，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。

1.6 轉染細胞的mRNA檢測

對轉染成功的成纖維細胞進行BMP4基因mRNA的定量檢測，利用TRIzol(Roche)對培養(yǎng)皿中的細胞進行裂解，提取細胞中的RNA并對濃度、純度進行檢測[13]，后反轉錄成cDNA。利用敖漢細毛羊BMP4和內參基因GAPDH的序列，設計BMP4和GAPDH的RT-PCR引物序列如表1所示。

表1 引物信息Tab.1 Primers information

實時熒光定量PCR程序按照實驗室已設定好的模式，退火溫度為58 ℃。樣品需要進行3次生物學重復，采用Ct(2-ΔΔCt)值法計算BMP4基因mRNA的相對表達量。利用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，結果以P<0.01作為差異極顯著性判斷標準[16]。

1.7 Western Blotting檢測BMP4基因蛋白表達

首先對細胞中的蛋白進行提取，制作膠塊進行點樣，用β-actin作為內參對照，220 V進行電泳。后對電泳的蛋白進行轉膜，轉膜后對蛋白用5% BSA 2 h進行封閉；對蛋白進行封閉之后用一抗二抗進行孵育，一抗按照1∶2 000比例稀釋，4 ℃孵育12 h；山羊抗兔的二抗按相同的比例稀釋，在搖床上均勻孵育1.5 h；后利用1∶1比例的曝光液在暗室中進行曝光上機拍照。用ImageJ 對所得蛋白條帶進行灰度值分析，對灰度值進行t檢驗[17]。

2 結果與分析

2.1 BMP4目的片段擴增

用cDNA做模板進行普通PCR，來擴增獲得BMP4目的基因片段。用電泳鑒定其結果如圖1所示，電泳跑出的條帶明亮無雜帶，且產物大小為1 230 bp左右，與已知的目的基因片段長度相同，膠回收明亮條帶用于后續(xù)的試驗。

M.2000 Marker；1-2.BMP4基因擴增條帶(1 230 bp)。 M.2000 Marker；1-2.BMP4 gene amplification bands(1 230 bp).

2.2 pGM-T-BMP4測序鑒定

對膠回收獲得的BMP4目的片段與pGM-T載體連接之后轉至DH5α中，搖菌使細菌進行大量復制，同時獲得大量BMP4-pGM-T載體，將獲得的BMP4-pGM-T用DNAMAN將測序結果與BMP4的已知CDS區(qū)進行比對，比對發(fā)現(xiàn)沒有堿基發(fā)生突變，與參考的序列完全一致(圖2)，可繼續(xù)下一步的表達載體的構建。

圖2 TA克隆測序對比鑒定Fig.2 Cloning sequencing comparison identification

2.3 pGM-T-BMP4的電泳鑒定及提取

將構建好的pGM-T-BMP4利用去內毒素質粒提取試劑盒提取出來，并進行電泳檢測(圖3)，已知BMP4片段大小為1 230 bp，pGM-T載體序列大小為3 489 bp，連接相加為4 719 bp。圖上的條帶位置在4 719 bp左右，與已知大小相符合，結果證明pGM-T-BMP4連接提取成功，可用于后續(xù)的酶切試驗。

M.10000 Marker；1-2.克隆載體提取后電泳產物(4 719 bp). M.10000 Marker；1-2.Electrophoresis products were extracted from cloned vectors(4 719 bp).

2.4 pGM-T-BMP4及pcDNA3.1載體雙酶切

對pGM-T-BMP4和pcDNA3.1載體分別進行雙酶切。切成三部分分別為：BMP4目的基因、pGM-T直鏈、pcDNA3.1直鏈，對BMP4目的基因和pcDNA3.1直鏈進行膠回收。結果如圖4所示，1-2：對pGM-T-BMP4的EcoRⅠ、KpnⅠ雙酶切，下部為BMP4，位置大約在1 230 bp處，上部是pGM-T載體位置大約在3 489 bp處，與已知序列的大小相符合。3-4：對pcDNA3.1的雙酶切，位置大約在5 428 bp處，與已知質粒序列大小相符合。因此,1-4可進行BMP4與pcDNA3.1的連接。

M.5000 Marker；1-2.克隆載體EcoR Ⅰ、KpnⅠ雙酶切； 3-4.pcDNA3.1載體EcoR Ⅰ、KpnⅠ雙酶切。 M.5000 Marker；1-2.Cloning vector EcoR Ⅰ，Kpn Ⅰ double digests ； 3-4.pcDNA3.1 vector EcoR Ⅰ，Kpn Ⅰdouble digests.

2.5 重組pcDNA3.1-BMP4的構建及鑒定

對膠回收的BMP4目的基因和直鏈pcDNA3.1進行連接，后進行轉化搖菌使重組質粒大量復制，進行菌液PCR鑒定，如圖5所示圖中單一明亮的條帶大約在1 230 bp處，與已知目的基因序列大小相符合，鑒定得到BMP4與pcDNA3.1連接成功。

M.5000 Marker；1-4.菌液PCR。 M.5000 Marker；1-4.Bacteria solution PCR.

圖6 表達載體菌液的測序比對Fig.6 Sequencing alignment of expression vector bacterial solution

2.6 pcDNA3.1-BMP4菌液測序鑒定

對pcDNA3.1-BMP4菌液進行堿基序列的測序，測序的結果用和已知的BMP4基因的序列進行比對(圖6)，BMP4構建到pcDNA3.1上后堿基沒有發(fā)生任何突變，并且在pcDNA3.1上能夠穩(wěn)定的存在。說明BMP4成功連接到了pcDNA3.1載體中，可進行下一步的轉染。

2.7 細胞觀察

2.7.1 原代細胞觀察 對原代細胞的生長情況進行觀察，成纖維細胞大約在24 h時開始貼壁，可以觀察到細胞從組織塊的周圍開始游出，形狀上表現(xiàn)為圓形、梭形，同時也可以用肉眼觀察到許多游離的組織。培養(yǎng)至第4天，培養(yǎng)皿的底部細胞達到了約95%，此時即可對細胞進行傳代(圖7)。

圖7 成纖維細胞原代培養(yǎng)(×100)Fig.7 Primary culture of fibroblasts(×100)

2.7.2 傳代細胞觀察 當細胞密度達到95%左右時對細胞進行傳代，經過3次的傳代后培養(yǎng)皿中的細胞只剩成纖維細胞。從生長速度來看傳代后細胞的生長速度先是比較緩慢，大約在12 h后生長速度會明顯加快(圖8)。

2.8 RT-PCR檢測BMP4基因mRNA的表達

首先對RT-PCR的引物進行驗證，PCR擴增之后進行電泳，電泳結果如圖9所示，結果表明，熒光定量的引物擴增出的目的條帶明亮無雜帶，GAPDH擴增產物大約在128 bp處，BMP4擴增產物大約在112 bp處，與已知的GAPDH、BMP4序列大小一致，因此設計的熒光定量引物可用于BMP4基因mRNA的定量。

圖8 成纖維細胞傳代培養(yǎng)(×100)Fig.8 Fibroblast subculture(×100)

M.500 Marker；1-2.內參基因GAPDH擴增條帶(A)； M.500 Marker；1-2.目的基因BMP4擴增條帶(B)。 M.500 Marker；1-2.Reference genes GAPDH(A)； M.500 Marker；1-2.Desired gene BMP4 amplification bands(B).

圖10是目的基因BMP4和內參基因GAPDH的擴增曲線、熔解曲線，曲線集中，有且只有一個峰值，此結果可以表明在進行熒光定量PCR時設計的熒光定量引物特異性很高，能夠擴增得到特定的目的片段。對轉染的細胞和未進行轉染的細胞mRNA表達量數(shù)據(jù)進行分析，可以得到BMP4基因經過表達載體構建轉染成纖維細胞后mRNA表達量明顯升高，且與未轉染的對照組之間表現(xiàn)出極顯著差異(P<0.01)(圖11)。

圖10 BMP4和GAPDH溶解曲線峰值圖(A)和擴增曲線圖(B)Fig.10 BMP4 and GAPDH dissolution curve peak map(A) and amplification curve(B)

不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。圖13同。 The different capital letters indicate that the difference is extremely significant(P<0.01).The same as Fig.13.

2.9 BMP4基因蛋白表達的檢測

對BMP4基因表達的蛋白進行Western Blot驗證，試驗結果顯示，經過表達載體構建且轉染后的成纖維細胞中BMP4基因蛋白條帶要明顯亮于未進行轉染的對照組(圖12)，利用ImageJ對蛋白條帶進行分析后對得到的數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，分析得試驗組BMP4基因蛋白表達量極顯著高于對照組(圖13)(P<0.01)。

圖12 BMP4基因表達蛋白條帶Fig.12 BMP4 gene expression protein band

圖13 BMP4基因蛋白相對表達量Fig.13 BMP4 gene protein relative expression

3 討論與結論

目前有很多的基因和轉錄因子在毛囊發(fā)育的過程中扮演著重要的角色，其中有Wnt通路[18-19]、TGF-β超家族[20-21]通路、各類生長因子[22]、BMPs及其受體[23]等。前人已有研究表明，BMP4基因是影響毛囊發(fā)育的一個關鍵性基因。有研究結果表明[11]，利用小鼠來研究BMP4基因可以在小鼠的毛囊形成時期以及出生后毛囊周期循環(huán)過程均有明顯的表達[24]，利用BMP4的正常表達可以進一步驗證了之前的推斷。同時利用基因敲除技術對BMP4基因的受體進行特異性的敲除來研究外部毛發(fā)的形態(tài)是否發(fā)生了改變間接的去證明BMP4在毛囊發(fā)育過程中的重要作用[25]。因此，目前在小鼠、山羊等身上研究BMP4與毛囊發(fā)育之間的關系時，都是通過質粒的構建或者敲除BMP4基因來間接分析該基因在毛囊發(fā)育中的作用[26]。有原位雜交試驗結果發(fā)現(xiàn)，BMP4基因在內蒙古絨山羊的表達和BMP2基因表達方向一致，均是在休止期的皮膚中高表達[27]，從而在皮膚毛囊發(fā)育中處于休止期時起到了關鍵性作用。通過在小鼠、山羊等身上的研究初步推斷，BMP4基因在敖漢細毛羊身上也可能參與毛囊發(fā)育，并且對毛囊的發(fā)育起到抑制作用。

本研究選擇成纖維細胞作為研究工具的原因在于成纖維細胞生長力、活力都比較強，容易獲得，有利于瞬時轉染。目前，沒有通過載體的構建對BMP4基因功能進行驗證的相關報道，本試驗很好地起到補充作用。本研究主要是通過比較成熟的載體構建技術對BMP4基因進行了載體的構建并將其轉染到成纖維細胞中，之后對此基因在mRNA水平上和蛋白水平進行定量定性分析，為下一步個體水平的研究提供基礎。同時經過轉染后的BMP4基因，mRNA達量明顯的升高， 通過NCBI上查閱到BMP4表達的蛋白大小為45 ku，利用WB進行了驗證對比，結果一致。經過顯色曝光后，肉眼初步可以判斷到試驗組蛋白條帶明顯比空白對照組的條帶明顯的黑、寬且。用ImageJ分析灰度值，試驗組的蛋白相對表達灰度值明顯高于對照組。這從蛋白水平上對BMP4基因進行了驗證。對BMP4基因進功能驗證不僅僅是對此基因的研究同時也會幫助此信號通路中其他基因的研究，BMP4基因過表達，可能會影響它直接控制受體、smad類等因子。相反，BMP4基因表達被抑制，也會引起一系列的連鎖反應。對BMP4基因功能進行驗證也為以后的個體水平上的研究提供了一定的參考，極大希望的解決綿羊羊毛生長的問題。

通過對BMP4基因表達載體的構建以及對基因mRNA和蛋白水平的檢測得出BMP4基因過表達，mRNA表達量和蛋白的表達量極顯著高于對照組，為進一步研究此基因的功能奠定了基礎。