毛霄彤 鄒文斌 孫暢 廖專

海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科，上海市胰腺病研究所，上海 200433

【提要】 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是采用新一代基因測(cè)序技術(shù)對(duì)細(xì)胞群體中每一個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行高分辨率檢測(cè)，以揭示生物組織中細(xì)胞的異質(zhì)性。該技術(shù)在鑒定特定細(xì)胞標(biāo)志物、發(fā)現(xiàn)細(xì)胞亞群和稀有細(xì)胞以及分析微環(huán)境中細(xì)胞間關(guān)系方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，目前在腫瘤、發(fā)育、干細(xì)胞、微生物、神經(jīng)科學(xué)等研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。

每個(gè)細(xì)胞都是與眾不同的獨(dú)立個(gè)體，很多細(xì)胞構(gòu)成完整的組織，并最終形成功能及表型。常見的多細(xì)胞批量測(cè)序(bulk RNA-sequencing，bulk RNA-seq)通常對(duì)組織樣本或細(xì)胞群進(jìn)行測(cè)定，容易使細(xì)胞間的差異被平均值所掩蓋，難以鑒別異質(zhì)性群體中各個(gè)細(xì)胞亞群的轉(zhuǎn)錄組特征。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(single-cell RNA-sequencing，sc RNA-Seq)技術(shù)完美解決了這一問題，為研究群體中的不同類型細(xì)胞提供了可能。胰腺是一個(gè)由復(fù)雜細(xì)胞組成的器官,在內(nèi)外分泌功能方面發(fā)揮重要作用。近年來胰腺領(lǐng)域開展的單細(xì)胞測(cè)序研究使人們對(duì)胰腺細(xì)胞類型、狀態(tài)和亞群的認(rèn)識(shí)更為深入，并對(duì)病理狀態(tài)下的特定細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組特征進(jìn)行了精確描述。

一、胰腺的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組特征

成熟胰腺可分為內(nèi)分泌部和外分泌部，其中外分泌部約占胰腺的95%，主要由導(dǎo)管和腺泡細(xì)胞組成[1]。內(nèi)分泌部胰島由5種內(nèi)分泌細(xì)胞組成，包括α、β、γ、δ和ε細(xì)胞，分泌不同的激素。細(xì)胞標(biāo)志物是識(shí)別細(xì)胞身份的重要工具，sc RNA-Seq對(duì)經(jīng)典的胰腺細(xì)胞標(biāo)志物進(jìn)行了驗(yàn)證，α、β、γ、δ和ε細(xì)胞分別用GCG、INS、PPY、SST、GHRL進(jìn)行鑒別[2]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)了一些新的候選標(biāo)志物，如腺泡細(xì)胞特異性表達(dá)PRSS1、CPA1、CTRB1、REG1B，導(dǎo)管細(xì)胞表達(dá)KRT19。此外，ACTA2、PDGFRA可作為活化胰腺星狀細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，RGS5可作為靜止胰腺星狀細(xì)胞的鑒別標(biāo)志物[3-4]。

sc RNA-Seq數(shù)據(jù)顯示，INS、PPY、SST的表達(dá)各占β、γ、δ細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本約50%，而 GCG和GHRL的表達(dá)各占α和ε細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本約20%[2]。不同物種的同一類型細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜存在差異，如α、β細(xì)胞中15%的高表達(dá)基因存在物種特異性[5]。多個(gè)研究報(bào)道了人類胰島中同時(shí)表達(dá)α和β細(xì)胞標(biāo)志基因的“中間細(xì)胞”，但沒有排除這是兩個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組同時(shí)被捕獲的可能[2,6]。

γ、δ、ε細(xì)胞是稀有內(nèi)分泌細(xì)胞，人們對(duì)這3類細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征了解有限。Digruccio等[7]發(fā)現(xiàn)小鼠δ細(xì)胞表達(dá)的部分受體與β細(xì)胞相一致，而Sstr1和Ghsr的表達(dá)僅限于δ細(xì)胞。多個(gè)研究將瘦素受體鑒定為δ細(xì)胞特異性受體[2-3,8-9]，表明δ細(xì)胞在調(diào)節(jié)食物攝入和能量平衡方面發(fā)揮重要作用。人類γ細(xì)胞除表達(dá)TPH1、SERTM1、SPOCK1、ABCC9和SLITRK6外，還表達(dá)高水平的轉(zhuǎn)錄因子MEIS2、ETV1、ID4和FEV，提示γ細(xì)胞與神經(jīng)元細(xì)胞存在相似性[2-3,9-10]。Segerstolpe等[2]發(fā)現(xiàn)ε細(xì)胞表達(dá)NPY1R、OPRK1、PTGER4和ASGR1等特異性受體基因。

二、sc RNA-Seq在胰腺發(fā)育領(lǐng)域的研究

為研究胰腺胚胎發(fā)育過程中的單個(gè)細(xì)胞變化特征，研究者對(duì)胚胎日(embryonic day，E)12.5、E13.5、E14.5、E16.5和E17.5的小鼠胚胎胰腺及早期人類胎兒胰腺進(jìn)行了sc RNA-Seq[11-14]。

內(nèi)分泌祖細(xì)胞(endocrine progenitors，EPs)是胚胎胰腺中的一種瞬時(shí)細(xì)胞類型，能產(chǎn)生5種內(nèi)分泌細(xì)胞，Ngn3的表達(dá)是EPs形成的必要條件。Scavuzzo等[12]利用sc RNA-seq技術(shù)在E14.5胰腺中鑒定出了4個(gè)Ngn3陽性細(xì)胞亞群，代表EPs的不同成熟階段。與E14.5的EPs不同，E16.5的EPs具有更高的β細(xì)胞形成傾向。Byrnes等[13]對(duì)小鼠胰腺胚胎發(fā)育時(shí)期的間皮和間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了精確分析，發(fā)現(xiàn)了一群特征性表達(dá)Fev的EPs 。Krentz等[15]對(duì)E15.5、E18.5的小鼠胰腺細(xì)胞和人類胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells，hESCs)衍生的EPs進(jìn)行分析，探究了β細(xì)胞從hESCs來源的可能性。

為了研究α、β細(xì)胞的發(fā)育軌跡，Qiu等[16]對(duì)小鼠胎兒到成體不同發(fā)育階段的α、β細(xì)胞進(jìn)行了sc RNA-Seq分析。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，α細(xì)胞和β細(xì)胞分別存在448和664個(gè)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的基因，表明這兩類細(xì)胞在成熟過程中使用不同的調(diào)節(jié)策略。早期β細(xì)胞異質(zhì)性反映了不同的起源、周期階段和成熟狀態(tài)，而成體β細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)均一。Zeng等[17]對(duì)不同發(fā)育階段β細(xì)胞進(jìn)行擬時(shí)序分析，揭示了增殖期β細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特征以及調(diào)節(jié)氨基酸代謝、線粒體呼吸和活性氧產(chǎn)生的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平變化。

三、sc RNA-Seq在糖尿病領(lǐng)域的研究

單細(xì)胞研究拓展了β細(xì)胞在病理狀態(tài)下的異常基因表達(dá)譜。Baron等[3]發(fā)現(xiàn)糖尿病β細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)減少，提示β細(xì)胞異質(zhì)性消失。Wang等[18]確定了3個(gè)不同β細(xì)胞亞群,其中2個(gè)亞群表達(dá)細(xì)胞增殖相關(guān)基因Ki67，其比例在是否患2型糖尿病(type 2 diabetes，T2D)、不同年齡和身體質(zhì)量指數(shù)的人群中存在差異。Segerstolpe等[2]根據(jù)RBP4和GPR120鑒定出2個(gè)β細(xì)胞亞群，其中RBP4促進(jìn)胰島素抵抗，GPR120參與誘導(dǎo)胰島素分泌。

T2D患者和健康人群胰島的sc RNA-Seq數(shù)據(jù)提示β細(xì)胞在病理狀態(tài)下存在去分化現(xiàn)象。T2D患者的β細(xì)胞表現(xiàn)出幼年內(nèi)分泌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特征，伴隨CDKN2B、BARD1、JUNB和PRKD1的表達(dá)增加[6]，而INS轉(zhuǎn)錄水平相比于健康對(duì)照組顯著降低[2]。這些發(fā)現(xiàn)表明T2D患者的β細(xì)胞不能維持完全分化的基因表達(dá)譜，繼而影響內(nèi)分泌功能。

sc RNA-Seq研究發(fā)現(xiàn)健康人群和T2D患者的胰島α細(xì)胞存在200個(gè)差異表達(dá)基因，不同研究間差異基因的重疊率為35%[1]。單細(xì)胞測(cè)序?qū)币姷脑鲋承驭良?xì)胞進(jìn)行鑒定和轉(zhuǎn)錄分析[2,6,16]，Wang等[6]鑒定出高表達(dá)Ki67的單個(gè)增殖性α細(xì)胞，其表現(xiàn)為細(xì)胞周期途徑的激活和細(xì)胞周期檢查點(diǎn)控制基因的抑制。

四、sc RNA-Seq在胰腺腫瘤領(lǐng)域的研究

Bernard等[19]對(duì)2個(gè)低級(jí)別胰腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液腫瘤(intraductal papillary mucinous neoplasm，IPMN)、2個(gè)高級(jí)別IPMN和2個(gè)胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)樣本進(jìn)行sc RNA-Seq，通過不同階段的分析揭示了PDAC逐漸進(jìn)展的轉(zhuǎn)錄組變化。Peng等[4]繪制24個(gè)原發(fā)性PDAC和11個(gè)對(duì)照胰腺樣本的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜，發(fā)現(xiàn)PDAC內(nèi)腫瘤細(xì)胞具有異質(zhì)性和調(diào)節(jié)PDAC進(jìn)展的關(guān)鍵因素。此外，該研究通過特征性基因表達(dá)譜分離出了惡性導(dǎo)管細(xì)胞群，并發(fā)現(xiàn)具有高度增殖和遷移能力的亞群。

腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)是PDAC進(jìn)展和耐藥性的主要參與者。Elyada等[20]用sc RNA-Seq研究人和小鼠PDAC的腫瘤微環(huán)境，證實(shí)了肌纖維母細(xì)胞樣CAF和炎性CAF的存在，并定義了它們獨(dú)特的基因特征。此外，研究者發(fā)現(xiàn)了表達(dá)組織相容性復(fù)合體MHC Class Ⅱ和CD74的CAF群，將其定義為“抗原呈遞CAF”，它們以抗原呈遞方式激活CD4+T細(xì)胞，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突