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        不同pH條件下陰溝腸桿菌ODC基因的表達調(diào)控研究

        2020-01-06 07:30:02趙軒范亞紅劉利利劉秀葉竟雯盛曉鈺劉瓊馨
        生物化工 2019年6期
        關鍵詞:腐胺陰溝精胺

        趙軒,范亞紅,劉利利,劉秀,葉竟雯,盛曉鈺,劉瓊馨

        (1.長春師范大學生命科學學院,吉林長春130024;2.長春市九臺區(qū)營城第一高級中學,吉林長春130000)

        陰溝腸桿菌為革蘭氏陰性細菌,廣泛存在于土壤中,是植物根系的聯(lián)合固氮菌。多項研究表明,聯(lián)合使用該菌具有降解農(nóng)藥等環(huán)境污染物、提高農(nóng)作物產(chǎn)量的作用[1-4]。

        多胺參與細菌的多種應激反應[5-7],相關研究表明細菌在酸性條件下,通過控制轉錄與翻譯過程誘導產(chǎn)生與多胺合成相關的酶,并進一步誘導產(chǎn)生多胺以適應酸性條件[8-9]。本研究在不同酸堿條件下培養(yǎng)陰溝腸桿菌,檢測不同條件培養(yǎng)液中腐胺含量及ODC基因的表達調(diào)控,為進一步分析陰溝腸桿菌產(chǎn)多胺機制提供理論基礎。

        1 材料與方法

        1.1 實驗材料

        陰溝腸桿菌,由本實驗室篩選、保存。

        1.2 試劑

        ODC探針由北京鼎國生物技術有限公司合成,SYBR Green染料購自Thermo Fisher公司。

        多胺液相檢測所需色譜級乙腈、甲醇購自美國Fisher公司;苯甲酰氯購自Aladdin試劑公司。

        細菌培養(yǎng)液為ADF培養(yǎng)基。

        1.3 實驗方法

        1.3.1 細菌培養(yǎng)

        (1)挑取單菌落于10 mL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12~16 h。(2)吸取等量菌液接種于不同pH值的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12~16 h。

        1.3.2 樣品處理及液相檢測

        收集不同培養(yǎng)條件下陰溝腸桿菌上清液,冷凍干燥后用5 mL超純水溶解,取2 mL溶解液加入20 μL苯甲酰氯衍生,衍生完畢后向溶液中加入1 g氯化鈉、2 mL乙醚漩渦震蕩,將乙醚層移至5 mL離心管中,用氮氣吹干后以甲醇溶解抽濾,進行液相色譜檢測。

        1.3.3 定量PCR檢測不同pH條件下ODC基因的表達

        提取細菌RNA反轉錄,以SYBR Green I熒光定量法分析ODC基因的表達變化,退火溫度為55℃,72℃收集熒光信號。

        2 結果與分析

        2.1 液相法檢測菌體上清液中腐胺含量

        高效液相法檢測不同培養(yǎng)條件下上清液中腐胺含量,結果如圖1~2所示。在pH為5時上清液中無腐胺檢出,隨著pH值升高,陰溝腸桿菌上清液中腐胺含量升高,pH為8時約為0.25μg/μL,隨后上清液中腐胺含量降低,實驗3次重復,取平均值。圖1A為腐胺標品液相檢測,腐胺標品的保留時間為3.958,圖1B為不同pH條件下菌體上清液中腐胺分析結果。

        圖1 陰溝腸桿菌腐胺液相檢測圖譜

        圖2 不同pH培養(yǎng)條件下陰溝腸桿菌產(chǎn)腐胺含量變化

        2.2 不同pH條件下ODC基因表達定量分析

        以SYBR Green法通過定量PCR分析ODC基因的表達變化,實驗以16S rDNA為內(nèi)參,以pH為7的樣品結果為對照,(本研究主要是探討在酸堿條件下多胺合成基因的表達變化,所以選擇中性條件為對照)以其他實驗組與對照組的比值為結果作圖,結果如圖3所示。在pH為8時,ODC基因表達量最高,結果與液相檢測一致。

        圖3 不同pH條件下ODC基因表達調(diào)控變化

        3 討論

        本研究對不同酸堿條件下陰溝腸桿菌產(chǎn)腐胺情況及腐胺合成關鍵基因ODC的表達變化進行了研究分析。在pH為6和9時,腐胺含量下降,熒光定量分析不同pH條件下ODC基因的表達調(diào)控發(fā)現(xiàn),在pH為8的偏堿條件下該基因表達量最高,這與液相檢測結果一致。多胺是細菌生長、分化及生殖的必需元素,在逆境條件下細菌通過多胺的表達調(diào)控度過不良環(huán)境[7-8],本研究的結果表明陰溝腸桿菌在偏堿條件下ODC的表達升高,同時細菌上清液中腐胺含量最高,此結果說明腐胺合成變化可能是該菌適應堿性環(huán)境的主要原因,腐胺是精胺及亞精胺合成的主要底物,陰溝腸桿菌在偏堿條件下腐胺生成量升高,可進一步轉化為亞精胺及精胺[10],進而通過其他環(huán)節(jié)調(diào)控幫助細菌度過不良環(huán)境。

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