趙軒，范亞紅，劉利利，劉秀，葉竟雯，盛曉鈺，劉瓊馨

（1.長春師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130024；2.長春市九臺(tái)區(qū)營城第一高級中學(xué)，吉林長春130000）

陰溝腸桿菌為革蘭氏陰性細(xì)菌，廣泛存在于土壤中，是植物根系的聯(lián)合固氮菌。多項(xiàng)研究表明，聯(lián)合使用該菌具有降解農(nóng)藥等環(huán)境污染物、提高農(nóng)作物產(chǎn)量的作用[1-4]。

多胺參與細(xì)菌的多種應(yīng)激反應(yīng)[5-7]，相關(guān)研究表明細(xì)菌在酸性條件下，通過控制轉(zhuǎn)錄與翻譯過程誘導(dǎo)產(chǎn)生與多胺合成相關(guān)的酶，并進(jìn)一步誘導(dǎo)產(chǎn)生多胺以適應(yīng)酸性條件[8-9]。本研究在不同酸堿條件下培養(yǎng)陰溝腸桿菌，檢測不同條件培養(yǎng)液中腐胺含量及ODC基因的表達(dá)調(diào)控，為進(jìn)一步分析陰溝腸桿菌產(chǎn)多胺機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

陰溝腸桿菌，由本實(shí)驗(yàn)室篩選、保存。

1.2 試劑

ODC探針由北京鼎國生物技術(shù)有限公司合成，SYBR Green染料購自Thermo Fisher公司。

多胺液相檢測所需色譜級乙腈、甲醇購自美國Fisher公司；苯甲酰氯購自Aladdin試劑公司。

細(xì)菌培養(yǎng)液為ADF培養(yǎng)基。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)

（1）挑取單菌落于10 mL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～16 h。（2）吸取等量菌液接種于不同pH值的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～16 h。

1.3.2 樣品處理及液相檢測

收集不同培養(yǎng)條件下陰溝腸桿菌上清液，冷凍干燥后用5 mL超純水溶解，取2 mL溶解液加入20 μL苯甲酰氯衍生，衍生完畢后向溶液中加入1 g氯化鈉、2 mL乙醚漩渦震蕩，將乙醚層移至5 mL離心管中，用氮?dú)獯蹈珊笠约状既芙獬闉V，進(jìn)行液相色譜檢測。

1.3.3 定量PCR檢測不同pH條件下ODC基因的表達(dá)

提取細(xì)菌RNA反轉(zhuǎn)錄，以SYBR Green I熒光定量法分析ODC基因的表達(dá)變化，退火溫度為55℃，72℃收集熒光信號。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相法檢測菌體上清液中腐胺含量

高效液相法檢測不同培養(yǎng)條件下上清液中腐胺含量，結(jié)果如圖1～2所示。在pH為5時(shí)上清液中無腐胺檢出，隨著pH值升高，陰溝腸桿菌上清液中腐胺含量升高，pH為8時(shí)約為0.25μg/μL，隨后上清液中腐胺含量降低，實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)，取平均值。圖1A為腐胺標(biāo)品液相檢測，腐胺標(biāo)品的保留時(shí)間為3.958，圖1B為不同pH條件下菌體上清液中腐胺分析結(jié)果。

圖1 陰溝腸桿菌腐胺液相檢測圖譜

圖2 不同pH培養(yǎng)條件下陰溝腸桿菌產(chǎn)腐胺含量變化

2.2 不同pH條件下ODC基因表達(dá)定量分析

以SYBR Green法通過定量PCR分析ODC基因的表達(dá)變化，實(shí)驗(yàn)以16S rDNA為內(nèi)參，以pH為7的樣品結(jié)果為對照，（本研究主要是探討在酸堿條件下多胺合成基因的表達(dá)變化，所以選擇中性條件為對照）以其他實(shí)驗(yàn)組與對照組的比值為結(jié)果作圖，結(jié)果如圖3所示。在pH為8時(shí)，ODC基因表達(dá)量最高，結(jié)果與液相檢測一致。

圖3 不同pH條件下ODC基因表達(dá)調(diào)控變化

3 討論

本研究對不同酸堿條件下陰溝腸桿菌產(chǎn)腐胺情況及腐胺合成關(guān)鍵基因ODC的表達(dá)變化進(jìn)行了研究分析。在pH為6和9時(shí)，腐胺含量下降，熒光定量分析不同pH條件下ODC基因的表達(dá)調(diào)控發(fā)現(xiàn)，在pH為8的偏堿條件下該基因表達(dá)量最高，這與液相檢測結(jié)果一致。多胺是細(xì)菌生長、分化及生殖的必需元素，在逆境條件下細(xì)菌通過多胺的表達(dá)調(diào)控度過不良環(huán)境[7-8]，本研究的結(jié)果表明陰溝腸桿菌在偏堿條件下ODC的表達(dá)升高，同時(shí)細(xì)菌上清液中腐胺含量最高，此結(jié)果說明腐胺合成變化可能是該菌適應(yīng)堿性環(huán)境的主要原因，腐胺是精胺及亞精胺合成的主要底物，陰溝腸桿菌在偏堿條件下腐胺生成量升高，可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為亞精胺及精胺[10]，進(jìn)而通過其他環(huán)節(jié)調(diào)控幫助細(xì)菌度過不良環(huán)境。