陳文婧,郝興霞,張東澤
(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué),內(nèi)蒙古呼和浩特010021)
脂肪組織可以分成白色脂肪組織和棕色脂肪組織。人們通常所說(shuō)的脂肪組織是指白色脂肪組織,新鮮時(shí)呈黃色,該脂肪細(xì)胞為圓形或卵圓形,細(xì)胞內(nèi)含大的脂肪滴,主要分布于皮下組織、網(wǎng)膜和腸系膜等部位。
脂肪組織早期被人們認(rèn)為是儲(chǔ)存能量的器官?,F(xiàn)如今,人類生活水平不斷提高,由脂肪引起的一系列疾病也隨之高發(fā),人們逐漸意識(shí)到脂肪細(xì)胞的分化對(duì)脂肪細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能變化具有重大影響[1]。脂肪組織通過產(chǎn)生游離脂肪酸和炎性因子引起胰島素抵抗、脂代謝異常、內(nèi)皮功能障礙、血栓及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[2]。在臨床的病理診斷中,有很多富含脂肪組織(如乳腺組織)的病理切片,而切片質(zhì)量的好壞直接影響了醫(yī)生診斷的準(zhǔn)確性。脂肪組織結(jié)構(gòu)特殊,其常規(guī)石蠟切片大多結(jié)構(gòu)不完整,組織破損甚至脫落,給鏡下觀察帶來(lái)很多不便,直接影響了學(xué)生的學(xué)習(xí)和病理的診斷。因此脂肪組織被列為不易應(yīng)用術(shù)中快速活檢的范圍[3]?;诖耍緦?shí)驗(yàn)根據(jù)石蠟切片的常見問題,從取材、固定、脫水、透明、烤片、染色等步驟分析切片制作過程中的注意事項(xiàng)。
1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
甲醛溶液、95%乙醇溶液、無(wú)水乙醇、二甲苯溶液,分析純級(jí)別(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)、Solarbio蘇木精染液G1140500ml、Solarbio伊紅染液G1100500ml、切片石蠟500 g(北京首醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)科技有限公司)、10004160中性樹膠100g(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)
1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
KEDEEKD-BMⅢ電腦生物組織包埋機(jī)(南京依貝儀器設(shè)備有限公司);LeicaRM2235切片機(jī)、LeicaHi1220烤片機(jī)、LeicaHi1210撈片機(jī)均為L(zhǎng)eica公司生產(chǎn)。
MoticB1SERIES顯微鏡,Motic公司生產(chǎn)
1.2.1 取材和固定
采用乙醚麻醉法處死大鼠,十字法解剖,取腹腔皮下和腸系膜處脂肪組織。放入10%的甲醛溶液中固定12h后,將組織修成1m3的小塊,繼續(xù)固定24h。
1.2.2 脫水、透明、浸蠟和包埋
固定后的脂肪組織放入包埋盒中用流水沖洗12h以上,取出放入梯度乙醇溶液中脫水(70%乙醇3h、80%乙醇3h、90%乙醇過夜、95%乙醇Ⅰ1.5h、95%乙醇Ⅱ1.5h、100%乙醇Ⅰ1.5h、100%乙醇Ⅱ1.5h);脫水后脂肪組織放入二甲苯溶液中透明;透明后的脂肪組織放入包埋機(jī)中浸蠟包埋,蠟Ⅰ30min,蠟Ⅱ30min,蠟Ⅲ30min。
1.2.3 切片和染色
取包埋好的蠟塊連續(xù)切片,切片厚度6μm。用免洗載玻片撈片、烤片后,進(jìn)行HE染色。
處死大鼠取脂肪組織制作脂肪組織切片時(shí),如果不有效利用大鼠的其他組織器官,會(huì)造成對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的浪費(fèi)。因此取材時(shí)應(yīng)盡量在其他老師、學(xué)生做實(shí)驗(yàn)的同時(shí)取用組織,或者在學(xué)生上大鼠解剖課程時(shí)取材,從而避免浪費(fèi)。
由于脂肪組織內(nèi)含有大量的脂肪滴,密度較小,一般漂浮于固定液的上層,從而導(dǎo)致脂肪組織無(wú)法被徹底固定(如圖1)。本實(shí)驗(yàn)采用10%的甲醛溶液對(duì)組織進(jìn)行固定,組織在固定液中始終處于漂浮狀態(tài),因此在試驗(yàn)中要盡可能地延長(zhǎng)固定時(shí)間,以免因脂肪組織固定不徹底而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。
圖1 脂肪組織在福爾馬林固定液中漂浮
基于脂肪組織的特殊結(jié)構(gòu),應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)組織的脫水時(shí)間。在實(shí)驗(yàn)室沒有購(gòu)置組織脫水機(jī)的情況下,需要人工完成脫水過程,因此要合理設(shè)置脫水時(shí)間。既要保證脂肪組織在脫水劑中過夜,又要保證實(shí)驗(yàn)在合理的時(shí)間范圍內(nèi)完成,這是本實(shí)驗(yàn)中需要解決的一個(gè)重要問題。
脂肪組織和其他組織不同,如果透明時(shí)間不夠,二甲苯不能完全進(jìn)入脂肪細(xì)胞中,會(huì)影響組織的浸蠟,使得包埋后的組織會(huì)慢慢滲出脂肪滴,無(wú)法進(jìn)行切片。
脂肪組織在預(yù)熱時(shí)容易融化,因此選擇合適的烤片溫度尤為重要。溫度過高,組織因融化無(wú)法貼合于載玻片上;溫度過低,石蠟不易融化,會(huì)在組織處產(chǎn)生很多小氣泡,破壞組織結(jié)構(gòu),影響切片的質(zhì)量。
如圖2所示,脂肪細(xì)胞含大量脂肪滴,細(xì)胞核被擠在一側(cè),切片染色結(jié)果經(jīng)常是大面積粉染結(jié)構(gòu),而蘇木精染色細(xì)胞核著色較淺,不易觀察,影響切片質(zhì)量。為了得到染色效果較好的切片,應(yīng)該適當(dāng)延長(zhǎng)組織在蘇木精染液中的染色時(shí)間。
圖2 HE染色后的脂肪組織,細(xì)胞核著色較淺
石蠟切片是目前動(dòng)物組織細(xì)胞制片的主要方法之一。與冰凍切片相比,采用石蠟切片方法除對(duì)抗原敏感性有影響外,在細(xì)胞形態(tài)清晰度、陽(yáng)性反應(yīng)物斑塊顯色及降低假陽(yáng)性誤斷率等方面均占有優(yōu)勢(shì)[4]。在制作脂肪組織石蠟切片實(shí)驗(yàn)中,應(yīng)做到節(jié)約動(dòng)物實(shí)驗(yàn)材料,選擇合適的脫水、透明、烤片、染色時(shí)間,從而提高切片質(zhì)量,為今后的教學(xué)和臨床工作提供方便。