杜邦，單蓉蓉，谷正

（合肥工業(yè)大學(xué)土木與水利工程學(xué)院，安徽合肥 230009）

余氯被廣泛用于飲用水的處理，但研究表明當(dāng)細(xì)菌形成生物膜后，余氯對生物膜的消除能力會受到影響。一般來說，飲用水通常采用氯、氯胺、臭氧、碘和紫外線消毒等方式進(jìn)行處理，且相關(guān)測試顯示銅綠假單胞菌等細(xì)菌對氯、氯胺、臭氧或碘不具有特異抗性。根據(jù)Fitzgerald等[1]的研究，在25 ℃時(shí)，氯含量為0.5 mg/L的游泳池需要1～3 h才能獲得99.9%的銅綠假單胞菌的殺滅率；而天然水需要1 h能夠殺死其中99.9%的銅綠假單胞菌。Xue等[2]的研究表明，氯的存在會使細(xì)胞膜和膜相關(guān)聚合物的化學(xué)官能團(tuán)發(fā)生形變，阻止其可逆附著向不可逆附著的轉(zhuǎn)變，從而阻礙了生物膜在新的表面上的擴(kuò)散和定植；而分泌藻酸鹽胞外聚合物較多的菌種，在余氯存在的情況下則具有更高的存活率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實(shí)驗(yàn)所使用的菌種Pseudomonas aeruginosa（運(yùn)動型，Wild-Type PAO1）和PAO1 ΔfliC（敲除鞭毛相關(guān)基因fliC的銅綠假單胞菌，非運(yùn)動型變異株）由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

試劑：LB培養(yǎng)基（奧博星，北京）；CDF緩沖溶液（Na2HPO40.54 g/L、KH2PO40.88 g/L、pH=6.98分析純，國藥集團(tuán)，上海）；NaClO母液（分析純，國藥集團(tuán)，上海）、SYTO 63（20 μmol/L Invitrogen,Thermo Fisher Scientific）。

儀器：LX-B50高溫滅菌鍋（華泰，合肥）；Eppendorf離心機(jī)（5810R，德國）；DNP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱（名宸，合肥）；Lambda 25/35/45分光光度計(jì)（PE，美國）；SK-O180-E水平搖床（大龍，北京）；SW-CJ-1FD超凈工作臺（一恒，上海）；LSM710激光共聚焦顯微鏡（Zeiss，德國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)

以銅綠假單胞菌為例，確定細(xì)菌在不同濃度消毒劑脅迫下的初期附著情況。實(shí)驗(yàn)選擇在無菌環(huán)境下的靜止系統(tǒng)中進(jìn)行，選擇LB培養(yǎng)基作為營養(yǎng)來源，每個(gè)燒杯中營養(yǎng)條件一致。此外，設(shè)定一系列消毒劑的濃度梯度，消毒劑使用NaClO母液（上海國藥，分析純），在各反應(yīng)器中添加一定量的NaClO母液，使各反應(yīng)器環(huán)境中余氯濃度分別為0 mg/L（對照）、0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L和3.0 mg/L。另外，實(shí)驗(yàn)過程均在超凈工作臺上進(jìn)行，并封住杯口，避免雜菌污染。

實(shí)驗(yàn)開始前，在每個(gè)燒杯中平放三片PE載片（長×寬×高=3.0 cm×1.0 cm×0.2 cm），并加入相應(yīng)量的NaClO母液，搖勻后，分別將1 mL的兩種細(xì)菌菌懸液（已調(diào)整其OD600=0.5[3]）加入反應(yīng)器中靜置培養(yǎng)并開始計(jì)時(shí)，20 min后取樣并進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定，每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)有3個(gè)平行樣，以保證實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。

1.3 生物膜的可視化觀察

載片取出后，使用生理鹽水緩慢沖洗，為了研究不同濃度消毒劑環(huán)境下細(xì)菌的附著情況，需要對細(xì)菌進(jìn)行標(biāo)記與染色。染劑使用SYTO 63[4]。

對細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行觀察時(shí)，采用共聚焦激光顯微鏡LSM710與ZEN 2012 blue edition（Carl Zeiss Microscopy GmbH）軟件進(jìn)行組合分析。樣品放置到激光共聚焦顯微鏡下，使用顯微鏡的40倍物鏡進(jìn)行觀察，并用其中的Lambda-Z-stack對生物膜自上而下進(jìn)行掃描，選取的視野區(qū)域尺寸為425 μm×425 μm，每個(gè)像素的尺寸是0.42 μm×0.42 μm×1 μm。使用ZEN軟件對每個(gè)環(huán)境中附著在載片上的生物膜圖像進(jìn)行各個(gè)組分的拆分，得到各個(gè)組成成分在每一層上的圖像。

運(yùn)用圖像中得到的信息，對生物膜上每一層被染色的面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，包括各個(gè)單獨(dú)成分與組合成分，對染色面積與染色面積的比例（進(jìn)行計(jì)算與統(tǒng)計(jì)，可以得到總細(xì)胞在視野范圍內(nèi)的體積，隨后計(jì)算出單位面積上的附著細(xì)菌體積，體積的計(jì)算方法如公式1所示：

其中，α為體積計(jì)算時(shí)插入的參數(shù)，本文中選取參數(shù)為1/2[5]；dZ為圖像每一層的厚度，為1 μm；a是Z-stack中選取的第一個(gè)界面；b是Z-stack中選取的最后一個(gè)界面，面積覆蓋率是每一層上染色面積在視野面積（425 μm×425 μm）上所占的比例，可經(jīng)計(jì)算得到。

生物膜的厚度是研究生物膜結(jié)構(gòu)和外觀的重要參數(shù)，一般方法是統(tǒng)計(jì)出每個(gè)x-y像素中熒光物質(zhì)在z軸上的高度，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)可以得到每個(gè)像素中生物膜的厚度分布[6]。具體計(jì)算方法為：將面積覆蓋率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，作出面積分布圖，x軸為面積分布率；y軸為Z-stack上的層數(shù)；0點(diǎn)對應(yīng)的層數(shù)，為細(xì)菌總細(xì)胞數(shù)圖層上面積覆蓋率的峰值所在的層數(shù)，厚度的計(jì)算方法如公式2所示：

其中體積為公式1計(jì)算得出的該視野內(nèi)物質(zhì)的體積，面積分布律為該視野下某種物質(zhì)（總細(xì)胞、多糖、蛋白質(zhì)）的面積覆蓋率最大值。相關(guān)研究要求，以總細(xì)胞數(shù)的最大值所在的層數(shù)作為零點(diǎn)，繪制出生物膜中不同層數(shù)總細(xì)胞數(shù)的染色面積分布圖，蛋白質(zhì)與多糖則以該零點(diǎn)所在層數(shù)為基礎(chǔ)，各自繪出各自成分的染色面積分布圖，用以比較該成分在生物膜中的所處的位置和分布。

2 結(jié)果與分析

2.1 附著細(xì)菌形成生物膜體積

激光共聚焦顯微鏡下生物膜形態(tài)如圖1所示。

培養(yǎng)20 min后，對細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖2所示。在初期附著階段，運(yùn)動型細(xì)菌的附著量顯著高于非運(yùn)動型細(xì)菌（t檢驗(yàn)：P＜0.05），其平均附著量是非運(yùn)動型細(xì)菌的1.22倍。

圖1 不同消毒劑濃度下的生物膜形態(tài)（使用激光共聚焦顯微鏡觀察）

消毒劑濃度對兩種細(xì)菌的附著數(shù)量影響比較顯著（單因素方差分析：P＜0.05）。隨著初始消毒劑濃度的上升，兩種細(xì)菌的附著量表現(xiàn)出了先增加后降低的現(xiàn)象，并且在1.0 mg/L的消毒劑環(huán)境中達(dá)到了峰值，運(yùn)動型細(xì)菌為（13.13±0.29）μm3/μm2，而非運(yùn)動型細(xì)菌為（10.16±0.58）μm3/μm2。

圖2 不同消毒劑濃度下生物膜的體積

2.2 生物膜平均厚度

為進(jìn)一步觀察消毒劑的脅迫對生物膜形態(tài)形成的影響，對共聚焦激光顯微鏡所拍攝到圖像中生物膜的相關(guān)信息進(jìn)行了進(jìn)一步的分析，平均厚度的結(jié)果如圖3所示。對比兩種細(xì)菌的平均附著厚度可以發(fā)現(xiàn)，具有鞭毛結(jié)構(gòu)的運(yùn)動型細(xì)菌在附著過程中具有優(yōu)勢，能夠形成更厚的生物膜（t檢驗(yàn)：P＜0.05），這是由于鞭毛結(jié)構(gòu)有利于細(xì)菌尋找合適的吸附位點(diǎn)，并增加附著率。

此外，消毒劑濃度對細(xì)菌的平均附著厚度影響比較顯著（單因素方差分析：P＜0.05）。隨著消毒劑濃度的上升，運(yùn)動型細(xì)菌生物膜厚度從（13.79±1.15）μm上升至（16.14±4.10）μm，當(dāng)消毒劑濃度上升至3.0 mg/L時(shí)，厚度下降至（11.69±1.15）μm，對于非運(yùn)動細(xì)菌也發(fā)現(xiàn)了類似的規(guī)律，這說明中度的消毒劑濃度能促進(jìn)銅綠假單胞菌形成更加致密的生物膜。

圖3 不同消毒劑濃度下生物膜的平均厚度

3 結(jié)論

（1）運(yùn)動性能夠促進(jìn)細(xì)菌初期的附著行為，具有鞭毛結(jié)構(gòu)的細(xì)菌擁有更大的附著率，其附著體積與附著厚度都較非運(yùn)動型細(xì)菌更大。

（2）消毒劑濃度對細(xì)菌的初期附著行為影響顯著，且適當(dāng)濃度的消毒劑（1.0 mg/L）有利于促進(jìn)細(xì)菌的附著行為，使生物膜生長得更加致密。