劉靜，劉張虎，張雨霏

（湖北大學知行學院，湖北武漢430011）

蛋白酶是能夠催化蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì)分解的一類酶，其在工業(yè)用酶制劑中所占比例高達70%，在食品、釀造、醫(yī)藥、制革、絲綢脫膠等方面有著廣泛的應(yīng)用[1]。蛋白酶在食品行業(yè)的應(yīng)用主要是在烘焙、奶制品與豆制品加工過程或是紅酒、醬油的釀造中使用，在醫(yī)藥方面蛋白酶可以用于生產(chǎn)消炎劑、消化劑、高營養(yǎng)的注射用水等，在輕工業(yè)中可以用于絲綢脫膠、廢膠片的回收利用以及皮革皮毛脫毛軟化等工藝中[2]。同時蛋白酶也可以用于制造洗滌劑，其作為一種生物大分子對環(huán)境的危害遠小于普通的洗滌劑，從而減少了水體富營養(yǎng)化等問題，因此也被廣泛應(yīng)用于環(huán)保行業(yè)中[3]。

土壤中的微生物種類繁多，易于從中篩選出產(chǎn)蛋白酶的菌株。本實驗從學校周邊垃圾場淤泥、食堂排污水溝等含蛋白量較高的土壤中取樣，篩選分離出多個產(chǎn)蛋白酶菌株，通過復篩和蛋白酶酶活力測定，挑選出產(chǎn)酶活力較高的菌株，并改善該菌株發(fā)酵培養(yǎng)基部分成分，對篩選出的產(chǎn)蛋白酶菌株的產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化。

1 實驗材料

1.1 土壤樣本及菌種

本實驗所使用土壤樣本采集自湖北大學知行學院周邊，取樣地主要為食堂排水渠污泥、餐館垃圾處理處和學生公寓垃圾堆放處附近土壤。

土壤樣品中篩選得到并優(yōu)化培養(yǎng)的菌株為一株短桿細菌。

1.2 試劑

干酪素、氯化鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；牛肉膏、蛋白胨（均為生物試劑）：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；瓊脂粉（生物試劑）：上海山浦化工有限公司；磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、可溶性淀粉（均為分析純）：天津市廣成化學試劑有限公司；胰蛋白胨（生物試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；酵母提取物(分析純)：OXOID；葡萄糖、乳糖、蔗糖（均為分析純）：上海展云化工有限公司；果糖（生物試劑）：上海展云化工有限公司。

1.3 儀器及設(shè)備

7200型可見分光光度計：上海尤尼科儀器有限公司；SW-CJ-ZD型無菌操作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；TCYQ型恒溫搖床：太倉市實驗設(shè)備工廠；DH-9162型恒溫培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.4 培養(yǎng)基

（1）酪素培養(yǎng)基：0.3%牛肉膏，1.0%干酪素（加入少許1mol/LNaOH溶液加熱助溶），0.5%NaCl，2.0%瓊脂，pH7.4～7.8。

（2）LB固體培養(yǎng)基：1.0%胰蛋白胨，1.0%NaCl，0.5%酵母提取物，1.5%瓊脂，pH7.0。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)基：0.5%酵母提取物，1.0%胰蛋白胨，2.0%葡萄糖，0.5%NaCl，0.3%K2HPO4，0.7%KH2PO4。

（4）葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基：0.75g蛋白胨，0.75g葡萄糖，0.3gK2HPO4，150 mL H2O，pH7.0～7.2，過濾。

（5）淀粉水解培養(yǎng)基：1.0%蛋白胨，0.2%可溶性淀粉，1.5%NaCl，0.5%牛肉膏，2.0%瓊脂。

（6）糖發(fā)酵培養(yǎng)基：2.0%蛋白胨，10.0%糖類（葡萄糖、乳糖或蔗糖），0.5%NaCl，0.2%KH2PO4，0.03%溴麝香草酚藍（加入少量95%乙醇溶解）[4]。

2 實驗方法

2.1 菌株富集與初篩

每份土壤樣品加入無菌水稀釋，取稀釋液各0.1 mL均勻涂布于LB平板中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～36h后觀察菌落生長狀況，并挑選出清晰的單菌落在斜面培養(yǎng)基進行劃線培養(yǎng)。將分離出的菌株點樣接種于酪素培養(yǎng)基上，挑選出菌落周圍有透明圈的菌株，將其接種于LB平板上進一步劃線分離出單菌落[5]。

2.2 菌株復篩

將初篩所得菌株點樣接種于酪素平板上，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后挑選出5個透明圈與菌落直徑比比值較大的菌株，接種于50 mLLB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200r/min的搖床中培養(yǎng)24h后以1%的轉(zhuǎn)接量分別接種于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，在搖床中培養(yǎng)24h后取發(fā)酵液在4000r/min下離心10min，取上清液作為待測酶液進行蛋白酶酶活的測定[6]。

2.3 蛋白酶酶活的測定

本實驗采取的酶活測定方法改良自考馬斯亮藍G-250蛋白質(zhì)定量測定法，取不同濃度的酪蛋白溶液分別加入5 mL考馬斯亮藍G-250溶液，以不含酪蛋白的試管作為空白對照，測定595 nm處吸光度，以酪氨酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。首先繪制酪蛋白標準曲線。將發(fā)酵液以4 000 r/min離心10 min，取上清液作為待測酶液。在試管中加待測酶液1 mL，37℃下預熱5 min，再依次加入1mol/LNaOH溶液0.5 mL、0.2%酪蛋白溶液1 mL，37℃水浴10 min，取1 mL反應(yīng)液加5 mL考馬斯亮藍G250，5 min后于波長595 nm測吸光值[7]。以粗酶液加底物直接煮沸再加考馬斯亮藍G-250反應(yīng)作為空白對照[8]。

酶活（U）定義：在37℃每毫升發(fā)酵液每分鐘能夠分解的酪蛋白含量（μg）為1個酶活力單位。

酶活（U/mL）=A×K×N×0.25

其中，A表示吸光值，N表示酶液稀釋倍數(shù)，K表示吸光常數(shù)。

2.4 菌株的生長曲線和產(chǎn)酶曲線

從斜面中挑取篩選出的菌株接種至LB液體培養(yǎng)基中活化，在37℃、200 r/min的恒溫搖床中振蕩培養(yǎng)12 h后作為種子液使用。分別吸取0.5%、0.25%、0.1%種子液接種到100 mL的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200 r/min的恒溫搖床中振蕩培養(yǎng)，每隔2h取樣，測定培養(yǎng)液OD600值，并繪制菌株生長曲線[9]。

吸取1%種子液轉(zhuǎn)接至100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37℃、200 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h，每隔6 h取樣測定蛋白酶酶活力，并繪制菌株產(chǎn)酶曲線[10]。

2.5 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.5.1 不同碳源對菌株產(chǎn)酶的影響

將初始發(fā)酵培養(yǎng)基中2%的葡萄糖分別替換成2%的可溶性淀粉、蔗糖、乳糖和果糖，吸取1%的種子液加入含有不同碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度為37℃、轉(zhuǎn)速200 r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)1d后分別取樣測定酶活力，以酶活力最高的培養(yǎng)基中的碳源作為最適碳源[11]。

2.5.2 不同氮源對菌株產(chǎn)酶的影響

將初始發(fā)酵培養(yǎng)基中1%的蛋白胨分別替換成1%的尿素、牛肉膏、硫酸銨和硝酸鉀，吸取1%種子液加入含有不同氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度為37℃、轉(zhuǎn)速為200 r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)1d后分別取樣測定酶活力，以酶活力最高的培養(yǎng)基中的氮源作為最適氮源。

3 結(jié)果與分析

3.1 產(chǎn)蛋白酶菌株的初篩

經(jīng)LB培養(yǎng)基富集培養(yǎng)后，從平板上挑選50份單菌落進行初篩，初篩發(fā)現(xiàn)有19個菌株在菌落周圍形成明顯可見的透明圈，通過對這19個菌株的透明圈與菌落直徑比值的對比，挑選出5個比值較大的菌株進行復篩。這5個菌株分別為菌株A9、A20、A23、A28、A40。

3.2 酪蛋白標準曲線

酪蛋白標準曲線，該曲線線性回歸方程為：Y=0.069 3X+0.066 8，R2=0.991，其中縱坐標Y表示吸光值OD595，橫坐標X表示其對應(yīng)的酪蛋白含量。在酪蛋白含量為0～10 μg/mL的范圍內(nèi)，兩者具有良好的線性關(guān)系，當OD595值為1時，酪蛋白含量為13.5 μg/mL，即吸光常數(shù)K=13.5。

3.3 產(chǎn)蛋白酶菌株的復篩

分別對菌株A9、A20、A23、A28、A40進行搖瓶發(fā)酵復篩，取發(fā)酵液進行酶活測定。菌株A9、A20、A23、A28、A40的酶活分別為1.24 U/mL、1.83 U/mL、1.81 U/mL、2.03 U/mL、1.62 U/mL,其中菌株A28的透明圈直徑與菌落直徑的比值為10，酶活最高。

3.4 菌株的形態(tài)觀察

菌株A28在LB培養(yǎng)基上，菌落呈乳白色不透明狀，表面光滑，中間微凸，邊緣圓潤，具有少許黏性，易于挑取。在油鏡下觀察到菌株A28為短桿狀細菌。菌株A28可以分解利用葡萄糖、乳糖、蔗糖，不產(chǎn)酸；甲基紅反應(yīng)呈陰性；淀粉水解實驗呈陽性，表明該菌株可產(chǎn)生分解淀粉的酶；接觸酶測定呈陽性，表明該菌株可產(chǎn)生過氧化氫酶；無芽孢；為革蘭氏陽性菌。

3.5 菌株生長曲線和產(chǎn)酶曲線

如圖1所示，菌株A28在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)典型的微生物生長曲線。由于0.1%的種子液接種量較少，菌株的生長周期較短。菌株A28在前6 h快速增長，然后進入穩(wěn)定期，在12 h時達到峰值，然后菌體開始衰亡。

圖1 菌株A28的生長曲線

如圖2所示，菌株A28的產(chǎn)酶曲線前期呈現(xiàn)上升趨勢，產(chǎn)酶量逐漸升高，在30 h時產(chǎn)酶量達到峰值，然后開始下降。

3.6.1 不同碳源對菌株產(chǎn)酶的影響

如圖3所示，乳糖作為碳源時，A28酶活力最高，葡萄糖、果糖、蔗糖次之，而可溶性淀粉作為碳源時酶活最低。由此可知，菌株A28的最適碳源為乳糖。

圖2 菌株A28的產(chǎn)酶曲線3.6 發(fā)酵條件優(yōu)化

3.6.2 不同氮源對菌株產(chǎn)酶的影響

如圖4所示，尿素作為氮源時酶活力顯著高于其余4種氮源，牛肉膏、硫酸銨和蛋白胨次之，而硝酸鉀作為氮源時明顯酶活力較低。由此可知，尿素可為菌株A28的最適氮源。

圖3 不同碳源對菌株產(chǎn)酶的影響

圖4 不同氮源對菌株產(chǎn)酶的影響

4 結(jié)論

本實驗從6份不同來源的土壤樣品中初篩分離出19株能夠產(chǎn)生蛋白酶的菌株。經(jīng)過透明圈與菌落比值大小的比對，以及發(fā)酵產(chǎn)酶復篩進行酶活力測定后，篩選出一株產(chǎn)酶活力較高的菌株A28。通過對發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源和氮源的初步優(yōu)化，得到菌株A28的最適碳源為乳糖，最適氮源為尿素。初步優(yōu)化后的發(fā)酵條件為：0.5%酵母提取物、1.0%尿素、2.0%乳糖、0.5%NaCl、0.3%K2HPO4、0.7%KH2PO4，最佳培養(yǎng)時間為30h，溫度為37℃。