劉麗艷 劉若凡 黃寧 陳軍利

(四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，四川 成都 610041)

α2腎上腺素受體(α2-adrenergic receptor，α2-AR)屬于A類(lèi)(視紫紅質(zhì)類(lèi))G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)，分為α2A, α2B和α2C三種亞型。α2-AR與去甲腎上腺素、腎上腺素等內(nèi)源性配體結(jié)合，通過(guò)激活胞內(nèi)偶聯(lián)的G蛋白(主要是Gi/o，但也偶聯(lián)Gs和Gq蛋白)，引起下游信號(hào)分子環(huán)磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate，cAMP)水平變化，參與細(xì)胞反應(yīng)[1]。不同α2-AR亞型的分布和主要功能不同，α2A-AR占中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nerve system，CNS)中的90%，主要分布在前額葉皮質(zhì)(Prefrontal cortex，PFC)，主要功能是突觸前負(fù)反饋抑制去甲腎上腺素釋放、低血壓、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抑制癲癇患者癲癇發(fā)作[2]；而α2B-AR僅在丘腦有較少的表達(dá)。對(duì)α2-AR受體亞型具有高度選擇性的配體的缺乏，嚴(yán)重限制了α2B-AR藥理學(xué)功能的探索[3]。

研究顯示，使用不同長(zhǎng)度的連接子偶聯(lián)兩個(gè)藥效團(tuán)，可增加配體-受體的親和力和效力[4]。4-氨基喹啉類(lèi)化合物是由2至12個(gè)碳原子的烷烴鏈連接兩個(gè)4-氨基喹啉組成的化合物，對(duì)α2-AR具有較強(qiáng)的親和力，其中，C7對(duì)α2B-AR具有選擇性[5]。然而，C7與α2B-AR作用位點(diǎn)尚不清楚。本文旨在通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)方法及藥理學(xué)手段，探討C7對(duì)α2B-AR選擇性的分子機(jī)制，為研發(fā)α2B-AR選擇性藥物打下結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

COS-7細(xì)胞株，購(gòu)自ATCC，培養(yǎng)在含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中；胎牛血清購(gòu)自Hyaline公司；DMEM購(gòu)自Gebico公司。

1.2 方法

1.2.1α2B-AR同源模型的構(gòu)建及評(píng)價(jià)

從Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中，檢索人α2B-AR氨基酸序列(450個(gè)氨基酸，P18089)。在SWISS-MODEL中進(jìn)行序列對(duì)比，搜尋與目標(biāo)序列相匹配的模板。選擇同源性高、分辨率低、晶體結(jié)構(gòu)完整的受體作為構(gòu)建同源模型的模板，進(jìn)行建模。構(gòu)建好的模型采用ERRAT2和Ramachandran Plot進(jìn)行評(píng)分，最優(yōu)模型被采用。ERRAT2的可接受范圍是≥50%[6,7]。Ramachandran Plot評(píng)分值的可接受范圍>90%[8-10]。

1.2.2α2B-AR同源模型loop環(huán)的優(yōu)化

評(píng)分較差的loop環(huán)區(qū)域，利用MODELLER9.18進(jìn)行優(yōu)化，每個(gè)步驟生成50～100個(gè)模型，同樣采用ERRAT2和Ramachandran Plot進(jìn)行評(píng)分，選擇評(píng)分最高進(jìn)行下一步優(yōu)化，直至所有評(píng)分較差的loop環(huán)被優(yōu)化，最后采用ERRAT2和Ramachandran Plot對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.2.3分子對(duì)接(CDOCKER)

在Discovery Studio中，選定受體模型，根據(jù)模型腔定義口袋，改變結(jié)合球的大小至能夠包裹胞外環(huán)，選定用于對(duì)接的小分子，設(shè)置最大命中數(shù)為100，設(shè)置“Pose Cluster Radius”為0.5，余參數(shù)默認(rèn)，運(yùn)行CDOCKER。

1.2.4cAMP累積實(shí)驗(yàn)

COS-7細(xì)胞以密度2×105·ml-1接種于不透明96孔培養(yǎng)板中，100μl/孔，用Lipo2000轉(zhuǎn)染含α2B-AR基因的質(zhì)粒DNA至COS-7細(xì)胞中，在37℃含有5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h。加無(wú)血清、雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞。每孔加入20 μl含有1 mM IBMX、30 μM Forskolin和不同濃度梯度(10-10～10-3M)待測(cè)藥物的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于在37℃含有5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育30 min。待培養(yǎng)板靜置至室溫后，使用cAMP- GloTMAssay試劑盒按操作說(shuō)明處理各孔細(xì)胞。最后使用酶標(biāo)儀在562 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔發(fā)光強(qiáng)度，以反映各孔cAMP水平。

2 結(jié)果

2.1 α2B-AR同源模型的構(gòu)建及優(yōu)化

通過(guò)SWISS-MODEL構(gòu)建α2B-AR亞型的同源模型，利用ERRAT2對(duì)同源模型進(jìn)行評(píng)分，通過(guò)MODELLER對(duì)同源模型的胞內(nèi)外環(huán)錯(cuò)誤值較高的區(qū)域進(jìn)行優(yōu)化，并評(píng)價(jià)優(yōu)化后的同源模型的質(zhì)量。結(jié)果顯示，ERRAT2和Ramachandran Plot對(duì)構(gòu)建的α2B-AR同源模型評(píng)分分別為85.054(圖1A)和94.4%(圖1B)。ERRAT2評(píng)分中得分較低的區(qū)域，圖中呈黑色的峰值，峰值越高，代表錯(cuò)誤值越高，對(duì)錯(cuò)誤區(qū)域處于loop環(huán)的氨基酸進(jìn)行優(yōu)化，α2B-AR優(yōu)化區(qū)域位于loop環(huán)上145～170，200～215，225～245，300～310，320～330，335～345位氨基酸，每一區(qū)域的優(yōu)化生成20個(gè)模型，分別用ERRAT2評(píng)分，評(píng)分最高的模型再進(jìn)行下一區(qū)域的優(yōu)化，最后評(píng)分最高的模型采用ERRAT2和Ramachandran Plot評(píng)分分別為93.867(圖1C)和95.9%(圖1D)，得到的最終模型較優(yōu)化前評(píng)分增高，表明同源模型的質(zhì)量進(jìn)一步提高。

圖1 α2B-AR同源模型優(yōu)化前后的ERRAT2和Ramachandran Plot評(píng)分注：A：優(yōu)化前ERRAT2評(píng)分；B：優(yōu)化前，Ramachandran Plot評(píng)分；C：優(yōu)化后ERRAT2評(píng)分；D：優(yōu)化后，Ramachandran Plot評(píng)分。

2.2 α2B-AR同源模型的質(zhì)量檢測(cè)

通過(guò)CDDOCKER分子對(duì)接，對(duì)上述構(gòu)建并優(yōu)化的α2B-AR同源模型進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。在胺類(lèi)GPCRs中，位于第Ⅲ跨膜螺旋的氨基酸殘基D3.32高度保守，作用于該類(lèi)受體正性位點(diǎn)的配基與此氨基酸有成鍵作用，在α2B-AR中D3.32氨基酸對(duì)應(yīng)的是Asp92，據(jù)此，我們利用α2-ARs已知的激動(dòng)劑去甲腎上腺素和拮抗劑酚妥拉明分別與構(gòu)建的α2B-AR同源模型進(jìn)行分子對(duì)接，來(lái)檢驗(yàn)同源模型的質(zhì)量。結(jié)果顯示，去甲腎上腺素與α2B-AR同源模型的Asp92、Ser176、Tyr391形成離子鍵(圖2A)，酚妥拉明與該受體Asp92、Tyr172形成離子鍵，與Tyr391、Phe412形成π-π鍵(圖2C)。此外，去甲腎上腺素和酚妥拉明均位于α2B-AR的正性結(jié)合口袋(圖2B，2D)。去甲腎上腺素和酚妥拉明均能與α2B-AR同源模型Asp92成鍵，表明我們構(gòu)建的α2B-AR同源模型質(zhì)量較高，可進(jìn)行下一步的分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)。

圖2 去甲腎上腺素、酚妥拉明與α2B-AR同源模型分子對(duì)接注：A、B：去甲腎上腺素；C、D：酚妥拉明

2.3.4氨基喹啉類(lèi)化合物(C7)與α2B-AR同源模型結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)

為了檢測(cè)C7與α2B-AR的相互作用位點(diǎn)，我們通過(guò)CDDOCKER將C7與α2B-AR同源模型進(jìn)行分子對(duì)接。C7與α2B-AR同源模型分子對(duì)接后產(chǎn)生100個(gè)對(duì)接模式，從對(duì)接模式最集中的簇中，選評(píng)分最高的對(duì)接模式進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，C7與α2B-AR的Glu73形成氫鍵，與Tyr391、Phe408、Phe412形成π-π鍵(圖3A)，以此推測(cè)這些位點(diǎn)參與C7與α2B-AR相互作用。此外，與去甲腎上腺素和酚妥拉明不同，C7位于不同于α2B-AR正性位點(diǎn)的胞外段(圖3B)。

圖3 C7與α2B-AR同源模型分子對(duì)接注：A：俯視圖；B：正視圖

2.4 C7對(duì)表達(dá)α2B-AR的COS-7細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的影響

去甲腎上腺素在10-10～10-3M濃度范圍內(nèi)可以刺激COS-7細(xì)胞內(nèi)cAMP增加(縱坐標(biāo)熒光檢測(cè)值越低，細(xì)胞產(chǎn)生cAMP量越多)(圖4A)，C7在10-10～10-3M濃度范圍內(nèi)對(duì)COS-7細(xì)胞內(nèi)cAMP水平無(wú)顯著影響(圖4B)。

圖4 不同化合物對(duì)表達(dá)α2B-AR的COS-7細(xì)胞內(nèi)cAMP分子水平的影響注：A：去甲腎上腺素(NA)；B：C7

3 討論

α2-ARs屬于GPCRs的一個(gè)分支-胺類(lèi)受體，分為三個(gè)亞型α2A-AR、α2B-AR、α2C-AR，其廣泛分布于全身不同組織，參與調(diào)節(jié)許多的生理病理過(guò)程，因此，α2-ARs激動(dòng)劑和拮抗劑的潛在治療應(yīng)用很多[11]。傳統(tǒng)的藥物研發(fā)主要靶向于GPCRs內(nèi)源性配體結(jié)合位點(diǎn)即正性結(jié)合位點(diǎn)，但其高度結(jié)構(gòu)同源性嚴(yán)重阻礙了亞型選擇性配體的研發(fā)，也是其產(chǎn)生副作用的主要原因之一。研究顯示，靶向別構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行受體亞型選擇性化合物的設(shè)計(jì)是一種有效的方法[12]。別構(gòu)調(diào)節(jié)劑與受體的別構(gòu)調(diào)節(jié)位點(diǎn)結(jié)合后，會(huì)使受體分子的構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而使受體的正性結(jié)合位點(diǎn)的構(gòu)象發(fā)生改變，從而增強(qiáng)(正向別構(gòu)調(diào)節(jié)劑)或減弱(負(fù)向別構(gòu)調(diào)節(jié)劑)外源性激動(dòng)劑或內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)與受體的親和力和/或效力[13]。

前期研究顯示，C7對(duì)α2B-AR具有選擇性。本研究首先通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)的方法預(yù)測(cè)了C7與α2B-AR的結(jié)合模式和相互作用位點(diǎn)。首先，我們構(gòu)建了α2B-AR同源模型，并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化前后采用ERRAT2和Ramachandran Plot進(jìn)行評(píng)分。ERRAT2評(píng)分是根據(jù)蛋白受體不同原子之間的非鍵合作用并與結(jié)構(gòu)高度精細(xì)的蛋白進(jìn)行對(duì)比，其優(yōu)點(diǎn)是能夠定位模型結(jié)構(gòu)不佳的區(qū)域，評(píng)分50分以上可接受[7]。Ramachandran Plot可以確定蛋白質(zhì)模型的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)的質(zhì)量和精確度，其評(píng)分>90%可接受[10]。優(yōu)化后ERRAT2錯(cuò)誤值較高的黑色峰值區(qū)域已明顯減少，Ramachandran Plot評(píng)分升高，評(píng)分均在可接受的范圍內(nèi)，其質(zhì)量符合要求。Ramachandran Plot中有18個(gè)氨基酸在非允許區(qū)，經(jīng)核對(duì)它們不位于存在別構(gòu)調(diào)節(jié)位點(diǎn)的受體胞外區(qū)，對(duì)我們的研究影響不大，但后期我們可以對(duì)該模型進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，以期獲得更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

在腎上腺素受體中，其正性結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸D3.32(Asp)是高度保守的，內(nèi)源性配體可與此氨基酸成鍵[14]。分子對(duì)接結(jié)果顯示，α2B-AR的激動(dòng)劑去甲腎上腺素可與α2B-AR的D3.32(Asp92)，Ser176和Tyr391形成氫鍵，而拮抗劑酚妥拉明與α2B-ARAsp92、Tyr172形成氫鍵，與Tyr391、Phe412形成π-π鍵。以上結(jié)果表明，去甲腎上腺素和酚妥拉明均位于α2B-AR的正性結(jié)合位點(diǎn)，說(shuō)明我們構(gòu)建的α2B-AR同源模型質(zhì)量較高。C7與α2B-AR的分子對(duì)接結(jié)果顯示，C7與該受體的Asp92沒(méi)有成鍵作用，但是可與受體胞外區(qū)域的Glu73形成氫鍵，與Tyr391、Phe408、Phe412形成π-π鍵，說(shuō)明C7可能是通過(guò)一種的新的作用方式，即別構(gòu)調(diào)節(jié)作用，與α2B-AR結(jié)合，進(jìn)而影響下游信號(hào)。

cAMP累積實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，去甲腎上腺素作為α2-AR的激動(dòng)劑，可以刺激表達(dá)α2B-AR的COS-7細(xì)胞內(nèi)cAMP增加，而C7在10-10～10-3M濃度范圍內(nèi)對(duì)COS-7細(xì)胞內(nèi)cAMP的產(chǎn)生沒(méi)有影響。說(shuō)明，C7本身對(duì)α2B-AR沒(méi)有激活或者抑制作用，可能會(huì)通過(guò)對(duì)α2B-AR的別構(gòu)調(diào)節(jié)作用來(lái)影響下游信號(hào)的傳導(dǎo)。

本研究首次提出了α2B-AR可能存在的別構(gòu)調(diào)節(jié)位點(diǎn)，為將來(lái)研發(fā)α2B-AR選擇性藥物打下結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。