張荔 李漢娜 張雪芹 岳利民△

(1. 四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院；2.四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院生理學教研室，四川 成都 610041)

卵巢分泌的雌激素除了影響生殖系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能外，同樣影響機體代謝及其他系統(tǒng)功能活動，尤其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能活動存在重要的調(diào)節(jié)作用。圍絕經(jīng)期女性的卵巢功能開始逐漸減退至衰竭，導致外周血清雌激素水平降低，進而使得卵泡刺激素(Follicle-stimulating-hormone，F(xiàn)SH)短暫負反饋性上升。由于雌激素匱乏，絕經(jīng)女性神經(jīng)系統(tǒng)的功能活動也發(fā)生一系列與衰老相關的退行性病變。大量證據(jù)表明，絕經(jīng)期女性阿爾茲海默癥(Alzheimer′s disease，AD)、帕金森綜合癥(Parkinson′s disease，PD)，以及腦卒中(Stroke)和多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis，MS)[1,2]發(fā)病率明顯上升，尤其是與脂代謝緊密相關的AD在絕經(jīng)后女性中發(fā)病率是男性的2-3倍[3]。并且，絕經(jīng)前行雙側(cè)卵巢切除術則引起神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的可能性進一步增加[4]。動物實驗及流行病學調(diào)查均表明，絕經(jīng)后雌激素替代治療(Oestrogen-replacement therapy，ERT)對認知和記憶功能有明顯的改善作用[5-7]。然而雌激素對神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用機制目前尚不明確。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能都與脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)維持有關[8]，雌激素也與脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的維持存在密切關系。美國國家健康和營養(yǎng)調(diào)查(NHANES)結(jié)果顯示，55歲-64歲女性平均低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDL-C)水平相比35歲-44歲女性增高24%左右，同比之下，男性LDL-C水平差異僅為6%[9]。雙側(cè)卵巢切除術后血清LDL-C異常增加，與年齡相關的LDL-C增加趨勢相似，說明雌激素對降低血清LDL-C起著重要作用[10]。

人類枯草溶菌素轉(zhuǎn)化酶9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)是近年來發(fā)現(xiàn)的脂代謝負調(diào)控因子，通過與低密度脂蛋白受體(Low density lipoprotein receptor，LDLR)結(jié)合，使細胞膜LDLR內(nèi)吞降解，從而減少可循環(huán)利用的LDLR數(shù)量，引起血清LDL-C異常增高，進而誘發(fā)高脂血癥[11-13]。PCSK9在腦中也有相應表達，而且在AD患者腦脊液中PCSK9表達明顯增加，參與AD的發(fā)病過程[14]。而LDL-C水平的異常增高也與AD等神經(jīng)退行性疾病存在密切聯(lián)系[15,16]。也有文獻報導女性循環(huán)系統(tǒng)中雌激素與PCSK9呈負相關[17]，絕經(jīng)后女性循環(huán)PCSK9水平明顯上升[18-20]。

本實驗分別以去勢雌性小鼠及回補雌激素后的去勢小鼠作為實驗對象，分別用RT-qPCR，免疫組化，Western Blot及HE染色研究小鼠腦內(nèi)PCSK9定位表達及雌激素是否影響腦內(nèi)PCSK9表達，據(jù)此分析雌激素缺乏是否通過影響PCSK9表達進而參與神經(jīng)系統(tǒng)相關病變的發(fā)病，從而為圍絕經(jīng)期后的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制研究提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

SPF級雌性C57BL/6J小鼠，6周齡，13-15 g，購自成都達碩生物科技有限公司(SCXK(川)2015-030)，于標準環(huán)境條件(20℃，每天12小時光照，食用專用飼料及潔凈飲用水)下飼養(yǎng)至10周齡。

1.1.2主要試劑與抗體

ECL化學發(fā)光試劑盒、RI-PA裂解液、PMSF、BCA蛋白含量檢測試劑盒均購自Beyotime公司；多聚甲醛購自Biosharp公司；氯仿、異丙醇、甘氨酸、氯化鈉、戊巴比妥鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、檸檬酸鈉、檸檬酸等均購自成都科龍化工試劑有限公司；兔抗鼠一抗PCSK9(1：100，55206-1-AP)由美國Proteintech公司生產(chǎn)；兔抗β-Actin(bs-0061R)購自美國Bioss公司；PCSK9抑制劑Alirocumab，購自美國Sanofi & Aventis；環(huán)戊丙酸雌二醇(HY-B1100)購自MCE公司；DAB顯色試劑盒(ZLI-9018)以及兔SP試劑盒(SP-9001)購自中杉金橋公司；蘇木素購自南京建成公司。

1.1.3主要實驗儀器與設備

低溫高速冷凍離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司)、常溫離心機(上海安亭科學儀器廠)、超純水制造系統(tǒng)(UPH-I-20T，成都超純科技公司)、光學顯微鏡及石蠟切片機(德國 Leica 公司)、垂直電泳槽以及凝膠成像系統(tǒng)(美國 Bio-Rad 公司)、隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器公司)、渦旋振蕩儀(美國 SCILOGEX 公司)、脫色搖床(海門其林貝爾儀器制造有限公司)、酶標儀(瑞士 TECAN 公司)、高壓蒸汽滅菌鍋(MLS-3020，日本 SANYO 公司)。

1.2 方法

1.2.1動物實驗

15只10 w雌性C57BL/6J小鼠隨機分成3組：對照組小鼠行假手術，術后繼續(xù)飼養(yǎng)7 w；去勢組小鼠摘除卵巢后繼續(xù)飼養(yǎng)7 w；去勢后補雌激素組小鼠于去卵巢術后4 w開始補充雌激素，每7 d皮下注射一次(1 mg·kg-1)，共三次。各組小鼠均于17 w時頸椎脫臼處死，取出全腦，從中線處切開左右腦，左腦以4%多聚甲醛固定；右腦迅速分離出海馬和皮質(zhì)組織，立即放入液氮中凍存用于蛋白提取。所有小鼠于取材前行陰道涂片，保證小鼠取材時均處于動情前期。

1.2.2組織學HE染色

將石蠟包埋的組織切片(4 μm)，依據(jù)HE染色標準操作進行染色，光學顯微鏡下觀察。

1.2.3免疫組化

組織固定，石蠟包埋、切片，烤箱烘烤3 d。根據(jù)SP試劑盒說明書進行免疫組化染色。簡要步驟如下：切片托拉復水，消除內(nèi)源性過氧化氫酶，抗原修復，血清封閉，滴加兔抗鼠PCSK9一抗，4℃溫育過夜。復溫后滴加山羊抗兔二抗，后加入辣根酶標記鏈霉卵白工作液，應用DAB染色和蘇木素復染，鹽酸酒精分色，脫水透明，封片。在Motic圖像處理系統(tǒng)下觀察，并拍照記錄。胞漿呈棕黃色區(qū)域為染色陽性區(qū)域。

1.2.4Western Blot

組織樣品按1 g：6 ml加入蛋白裂解液(RIPA:PMSF=100:1)于冰上研磨至勻漿，低溫高速離心15 min(8000 rpm，預冷4 ℃)，取上清后置于-80 ℃冰箱保存待用。按說明書使用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測樣品蛋白濃度。

進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉的TBST中封閉2 h；將PVDF膜置于封閉液稀釋的1：1000的兔抗鼠PCSK9中，4℃孵育過夜；將PVDF膜放入用TBST按1:4000稀釋的辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L)中(TBST稀釋)，置于37℃環(huán)境中保持1 h；使用ECL試劑盒(碧云天，中國)處理，化學發(fā)光顯色，在BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)下觀察，并拍照記錄。

1.2.5統(tǒng)計處理

2 結(jié)果

2.1 PCSK9表達定位于海馬及皮質(zhì)

HE染色可見小鼠海馬組織CA3、CA2、CA1區(qū)形態(tài)(圖1A)。免疫組化染色結(jié)果顯示，小鼠腦內(nèi)PCSK9表達于海馬及大腦皮質(zhì)神經(jīng)元胞漿(圖1B)。Western Blot檢測也進一步確定了PCSK9蛋白在海馬及大腦皮質(zhì)的表達，其表達量無明顯差異(圖1C，D)。

圖1 PCSK9在小鼠海馬及皮質(zhì)的定位與表達注：A：HE染色顯示海馬CA3、CA2、CA1區(qū)形態(tài)；B：免疫組化檢測PCSK9在腦內(nèi)表達于海馬及大腦皮質(zhì)神經(jīng)元胞漿；C：Western Blot檢測海馬及皮質(zhì)PCSK9蛋白表達情況；D：WB灰度分析

2.2 雌激素負調(diào)控海馬PCSK9蛋白表達

去勢組小鼠海馬組織較對照組小鼠PCSK9表達增加(P<0.05)；而回補雌激素后，PCSK9含量較去勢組明顯降低，甚至低于假手術組(P<0.001)，見圖2。

圖2 雌激素負調(diào)控海馬PCSK9蛋白表達注：A 免疫組化染色；B 光密度分析

2.3 雌激素負調(diào)控大腦皮質(zhì)PCSK9蛋白表達

與海馬相似，去勢后小鼠大腦皮質(zhì)PCSK9蛋白表達較對照組有增加(P<0.05)；回補雌激素有效降低了PCSK9蛋白表達，同樣低于假手術組(P<0.001)，見圖3。

圖3 雌激素負調(diào)控大腦皮質(zhì)PCSK9蛋白表達注：A 免疫組化染色；B 光密度分析

3 討論

本研究目的在于探討雌激素缺乏是否會導致脂代謝負調(diào)控因子PCSK9腦內(nèi)異常表達。為此，我們將雌性小鼠進行去勢處理，模擬卵巢功能衰退所致雌激素水平降低狀態(tài)，部分去勢小鼠外源性補充雌激素，檢測各組小鼠腦內(nèi)PCSK9的表達及定位。結(jié)果顯示，PCSK9主要表達于腦內(nèi)海馬及大腦皮質(zhì)，雌激素缺乏使該蛋白表達異常增加，回補雌激素使該蛋白的表達顯著減少，甚至低于假手術組。

據(jù)文獻報道，雌激素能夠改善海馬的記憶效應[21，22]。在圍絕經(jīng)期及時補充雌激素能有效改善女性認知功能衰退及降低相關神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病風險[23]。神經(jīng)系統(tǒng)功能活動與腦內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的維持之間存在密切關系[24]。雌激素對中樞神經(jīng)功能的影響可能與其對脂代謝的調(diào)控有關。圍絕經(jīng)期婦女補充雌激素后可改善其脂代謝紊亂狀態(tài)，從而有利于神經(jīng)退行性疾病的防治[25]。近年新發(fā)現(xiàn)的PCSK9這一脂代謝負調(diào)控因子不僅能影響外周循環(huán)系統(tǒng)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，也影響腦內(nèi)脂代謝[26，27]。腦內(nèi)海馬區(qū)是學習記憶形成及長時記憶儲存轉(zhuǎn)換的重要部位[28]，大腦皮質(zhì)同樣參與學習記憶過程[29，30]。根據(jù)功能的不同，海馬又被分為CA1區(qū)，CA2區(qū)，CA3區(qū)。在AD的發(fā)病過程中，海馬這些區(qū)域的β淀粉樣斑塊形成及神經(jīng)纖維糾纏極大程度上導致了AD患者記憶功能衰退的發(fā)生。還有研究報導，高脂血癥小鼠海馬神經(jīng)元PCSK9升高的同時，β-分泌酶(β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme-1，BACE1)這一與AD發(fā)病有關的蛋白酶的表達水平也隨之升高，表明脂代謝紊亂所誘發(fā)的神經(jīng)凋亡也與PCSK9異常表達有關[26]。

已經(jīng)有研究者證明在外周組織，PCSK9通過結(jié)合肝細胞膜表面的LDLR，減少肝臟膽固醇攝取從而造成高脂血癥，顯然，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，PCSK9同樣參與到了局部脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的維持。神經(jīng)系統(tǒng)富含功能性脂質(zhì)，雌激素可以通過非受體介導途徑調(diào)節(jié)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)從而改善神經(jīng)系統(tǒng)相關病變[31]，而圍絕經(jīng)期雌激素缺乏所導致的脂代謝紊亂可能導致神經(jīng)系統(tǒng)認知功能的改變[24]。本研究結(jié)果揭示PCSK9在腦內(nèi)主要表達定位于小鼠海馬及大腦皮質(zhì)，并且其表達水平受到雌激素的負調(diào)控作用，據(jù)此不難推測，在女性圍絕經(jīng)期后，由于雌激素缺乏，PCSK9這一脂代謝負調(diào)控因子表達的上調(diào)，也可能影響腦組織局部膽固醇攝取利用，導致腦組織局部脂代謝紊亂，進而引發(fā)一系列神經(jīng)系統(tǒng)退行性改變。本研究所得結(jié)果表明PCSK9在小鼠腦內(nèi)海馬及大腦皮質(zhì)表達，雌激素缺乏使其表達量異常增加，補充雌激素可以減少其表達。至于補充雌激素后海馬及皮質(zhì)區(qū)的PCSK9表達甚至低于假手術對照，可能是外源補充的雌激素水平與去卵巢前雌激素生理量差異所致。本研究結(jié)果揭示了圍絕經(jīng)期女性雌激素缺乏所致中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的一個重要的病理因素，從而為圍絕經(jīng)期女性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的診斷和治療研究提供了新線索。