張滿娥 黃文濱 盧志華 張洪彬

世界衛(wèi)生組織(WHO) 2018年發(fā)布的全球結(jié)核病報告指出，2017年全球有55.8萬例利福平耐藥結(jié)核病(rifampicin-resistant tuberculosis，RR-TB)和46萬例耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis,MDR-TB)患者，占新發(fā)結(jié)核病患者的3.5%和既往經(jīng)過治療的結(jié)核病患者的18%[1]。臨床上以異煙肼(INH)、利福平(RFP)、吡嗪酰胺(PZA)、鹽酸乙胺丁醇(EMB) 等為主導(dǎo)藥品的短程化療間歇療法，已成為世界多數(shù)國家認可的治療MDR/RR-TB的常規(guī)方案[2]。MTB-DNA陣列芯片法是采用基因芯片技術(shù)檢測結(jié)核耐藥基因ropB/katG/inhA的基因突變，可快速、早期、準(zhǔn)確評估到利福平和異煙肼的耐藥性，及時診斷MDR/RR-TB，可作為MDR/RR-TB早期篩查的方法[3]。為進一步了解福建省龍巖市肺結(jié)核患者的耐藥基因檢測情況，福建省龍巖市第二醫(yī)院分析了411份行基因芯片技術(shù)檢測耐藥基因的臨床標(biāo)本，旨為本地結(jié)核病患者提供抗結(jié)核方案制定和藥物選擇的依據(jù)。

對象和方法

一、研究對象

收集2016年5月12日至2019年8月17日福建省龍巖市第二醫(yī)院門診及收住入院并確診為肺結(jié)核的411例患者，其中初治患者312例，復(fù)治患者99例；男337例(82.0%)，女74例(18.0%)；年齡14～93歲，中位年齡54(41,65)歲。對初復(fù)治患者的411株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株采用基因芯片技術(shù)進行利福平與異煙肼耐藥性及其相關(guān)耐藥基因突變位點的檢測。

二、 檢測方法

(一) 儀器和試劑

HEMA 9600聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增儀由珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測芯片試劑盒、芯片雜交儀和微陣列芯片掃描讀片儀均由北京博奧生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

(二) 基因芯片技術(shù)

采用基因芯片技術(shù)檢測利福平和異煙肼耐藥基因。利福平耐藥相關(guān)基因ropB的野生型及不同突變位點分析共檢測6個突變位點，分別為511(T→C)、513(C→A)、516(G→T，A→T，A→G)、526(C→T，C→G，A→T，A→G)、531(C→T，C→G)、533(T→C)位點；異煙肼耐藥相關(guān)基因katG和inhA的野生型及不同突變位點分析，分別為katG基因啟動子315(G→C，G→A)位點和inhA基因啟動子-15(G→T)位點。

1.標(biāo)本處理：在不同類型的送檢標(biāo)本中，加入不同添加量的10%NaOH，置于室溫30 min或更多時間，直至標(biāo)本完全液化。

2.核酸提?。喝? ml液化的標(biāo)本于1.5 ml離心管中，以12 000×g離心5 min，棄上清后加入1 ml生理鹽水，振蕩混勻；再以12 000×g離心5 min，棄上清后在離心管中加入50 μl核酸提取液，振蕩混勻，將混勻后的溶液轉(zhuǎn)移至核酸提取管中，放入核酸快速提取儀中，以最大轉(zhuǎn)速振蕩10 min，置于95 ℃金屬浴5 min，以10 000×g離心1 min，備用。

3.PCR擴增：3個200 μl PCR管(標(biāo)號1、2、3)中分別加入18 μl擴增試劑，再分別加入2 μl樣本核酸，混勻，瞬時以2500×g離心數(shù)秒。擴增條件：37 ℃ 10 min；94 ℃變性10 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，45個循環(huán)；94 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，20個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。將PCR產(chǎn)物95 ℃變性5 min后立即冰水浴3 min。

4.雜交反應(yīng)：另取2個200 μl PCR管分別加入9 μl雜交緩沖液，其中1管加入PCR產(chǎn)物1和PCR產(chǎn)物2各3 μl用于利福平耐藥檢測，另1管加入PCR產(chǎn)物1和PCR產(chǎn)物3各3 μl用于異煙肼耐藥檢測。2個管均分別混勻，各取14 μl雜交混合物經(jīng)加樣孔加入芯片點陣中(微陣列1和3點陣用于檢測利福平耐藥，微陣列2和4點陣用于檢測異煙肼耐藥)，置50 ℃預(yù)熱好的雜交儀中雜交2 h。

5.洗片與芯片掃描：按說明書配制洗液Ⅰ和洗液Ⅱ，按已設(shè)置的洗滌程序洗片，甩干，然后將芯片插入芯片掃描儀中，運行結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測芯片判讀系統(tǒng)，軟件自動分析芯片圖像及給出判讀結(jié)果。結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測芯片試劑盒判讀結(jié)果為：雙敏(均為野生型)、單耐利福平、單耐異煙肼、雙耐(利福平和異煙肼均有位點突變)。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用Excel 2003和SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行整理、統(tǒng)計和分析。兩組患者分類計數(shù)資料采用“率，%”進行描述，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、411例肺結(jié)核患者對利福平和異煙肼的耐藥情況

411例肺結(jié)核患者中，利福平和異煙肼任一位點突變率為20.2%，其中利福平、異煙肼、利福平和異煙肼同時耐藥(簡稱“耐兩藥”)的耐藥率分別為5.4%、4.6%、10.2%。初治任一位點突變率(9.3%)明顯低于復(fù)治任一位點突變率(54.5%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=95.483，P<0.05)；初治耐兩藥率(2.9%)明顯低于復(fù)治耐兩藥率(33.3%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=75.944，P<0.05)。見表1。

二、不同性別、年齡組患者對利福平和異煙肼的耐藥情況

411例肺結(jié)核患者中，不同性別患者的耐藥率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；年齡組分布顯示，不同年齡組耐藥率由低到高依次為0～歲組、20～歲組、≥60歲組、40～歲組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1 411例初復(fù)治肺結(jié)核患者的耐藥情況

注耐兩藥指對利福平和異煙肼同時耐藥

表2 411例不同性別、年齡肺結(jié)核患者的耐藥情況

注耐兩藥指對利福平和異煙肼同時耐藥

三、結(jié)核分枝桿菌對利福平耐藥的相關(guān)基因ropB突變位點分析

耐藥基因技術(shù)檢測顯示，對利福平耐藥的ropB基因發(fā)生突變者22例，其中20例為單一位點突變，僅2例為雙位點突變。突變頻率最高的是531(C→T)，突變頻率為40.9%；其次是516(G→T)、526(C→T)、526(A→T)和531(C→G)，突變頻率均為9.1%。見表3。

表3 22例利福平相關(guān)耐藥基因ropB突變位點分布

四、結(jié)核分枝桿菌對異煙肼耐藥的相關(guān)基因katG和inhA的突變位點分析

耐藥基因技術(shù)檢測顯示，對異煙肼耐藥的katG基因和inhA基因共計有19例發(fā)生突變，其中13例為katG基因突變，突變率為68.4%；6例為inhA基因突變，突變率為31.6%。突變頻率最高的是315(G→C)，突變頻率為63.2%；其次是-15(G→T)，突變頻率為31.6%。見表4。

表4 19例異煙肼相關(guān)耐藥基因katG和inhA突變位點分布

五、結(jié)核分枝桿菌同時對利福平和異煙肼耐藥的相關(guān)基因突變位點分析

耐藥基因技術(shù)檢測顯示，同時對利福平和異煙肼耐藥的基因突變共計42例，其中40例為雙位點突變、1例為三位點突變、1例為四位點突變。突變頻率最高的是531(C→T)315(G→C)，突變頻率為47.6%。見表5。

表5 42例同時耐利福平和異煙肼的基因突變位點分布

討 論

福建省龍巖市下轄一市二區(qū)四縣，其結(jié)核病?？漆t(yī)療聯(lián)合體是以我院為牽頭單位，聯(lián)合各縣(市、區(qū))醫(yī)院組建而成。既往對龍巖市肺結(jié)核耐藥基因的研究報道較少[4-5]，特別是對一線抗結(jié)核藥物利福平和異煙肼相關(guān)耐藥基因未見報道。作為龍巖市結(jié)核病重點定點醫(yī)院，各縣(市、區(qū))醫(yī)院將轄區(qū)內(nèi)結(jié)核病急危重癥和并發(fā)疑難復(fù)雜疾病的特殊人群(包括孕產(chǎn)婦、兒童、HIV感染者等)的活動性肺結(jié)核，以及需手術(shù)治療的肺結(jié)核(包括規(guī)范抗結(jié)核藥物治療后仍有咳嗽、咳痰、咯血等癥狀或病灶局限的肺結(jié)核空洞、支氣管擴張、毀損肺、結(jié)核性肺不張等)、耐藥肺結(jié)核患者均轉(zhuǎn)診至我院，導(dǎo)致我院肺結(jié)核患者相對集中，也成為我院積極、早期采用基因芯片技術(shù)進行結(jié)核分枝桿菌臨床分離株對利福平與異煙肼耐藥性及其相關(guān)耐藥基因突變位點檢測的重要原因?；蛐酒夹g(shù)用于結(jié)核分枝桿菌對利福平、異煙肼耐藥性及其相關(guān)耐藥基因(rpoB/katG/inhA)的基因突變檢測，方法簡便、快速，可以針對臨床標(biāo)本直接檢測。但也存在菌量濃度要求在1×103CFU/ml及以上的檢出限，以及不能檢出結(jié)核分枝桿菌全部耐藥基因突變位點的局限性。

本研究結(jié)果顯示，利福平和異煙肼任一位點突變率為20.2%，與崔曉利等[6]報道陜西省西安市的19.52%相近，但明顯高于余云芳等[7]報道湖北省宜昌市的8.72%，可能與地區(qū)結(jié)核病疫情的差異有關(guān)，但也說明我市肺結(jié)核耐藥形勢嚴(yán)峻。另外，初治任一位點突變率(9.3%)和耐兩藥率(2.9%)明顯低于復(fù)治任一位點突變率(54.5%)和耐兩藥率(33.3%)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)，說明復(fù)治患者是耐藥結(jié)核病的重點關(guān)注人群。有研究認為，結(jié)核病治療史是結(jié)核病患者發(fā)生耐藥的危險因素[8]，而且由于初始強化治療肺結(jié)核推薦采用RFP+INH+EMB三聯(lián)或RFP+INH+PZA+EMB四聯(lián)方案[9-10]，未能根據(jù)患者病理生理特點行個體化用藥，如患者并發(fā)肝腎功能異常、糖尿病、艾滋病等，可能導(dǎo)致抗結(jié)核藥物劑量不足或劑量過高；或者由于利福平和異煙肼需空腹服用，較易產(chǎn)生藥物不良反應(yīng)，如嘔吐、頭暈，加之療程較長等因素，導(dǎo)致患者較難依從，出現(xiàn)不規(guī)范使用、自行停藥、中斷治療等，最終致結(jié)核分枝桿菌發(fā)生多態(tài)性基因改變，產(chǎn)生耐藥，治療失敗[11]。

本研究411例肺結(jié)核患者中，男性患者(82.0%)遠高于女性患者(18.0%)，說明本市肺結(jié)核患者以男性為主，與全球結(jié)核病患者的性別分布報道相一致[1]。可能與男性不健康的生活方式(飲酒、吸煙、熬夜、活動范圍大、交友廣泛)有關(guān)，尤其是吸煙會損害呼吸器官的屏障作用，進一步降低肺功能，增加誘發(fā)肺結(jié)核的可能性[8]。年齡組分析顯示，結(jié)核分枝桿菌感染率隨年齡增長依次遞增，40歲以上患者達74.2%，說明中老年人為結(jié)核感染的主要人群，與杜永成等[12]報道的活動性肺結(jié)核患病率、余云芳等[7]報道的結(jié)核分枝桿菌感染率隨年齡的增長而逐漸上升且肺結(jié)核患者呈老齡化趨勢相符。另外，本研究顯示任一位點突變率在不同性別、年齡組的分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，與梁慶福等[13]報道的福建省結(jié)核病耐藥性監(jiān)測結(jié)果相符，不同于崔曉利等[6]報道的陜西省西安市僅不同性別的患者差異無統(tǒng)計學(xué)意義的監(jiān)測結(jié)果；而且，任一位點突變率和同時對利福平和異煙肼的耐藥率高峰均在40歲以上患者中，與余云芳等[7]報道的20～歲組耐藥率(10.82%)為最高不同，可能與地域人口構(gòu)成情況差異有關(guān)，也可能與40歲以上的中老年人群多并發(fā)肺部疾患、糖尿病、高血壓、冠心病、慢性腎臟病、艾滋病、惡性腫瘤、乙或丙型肝炎、自身免疫性疾病等危險因素較多，治療方案選擇難度大，藥物不良反應(yīng)多，治療效果差，是耐藥結(jié)核病的易感人群有關(guān)[12，14]。

利福平是通過作用于DNA依賴的RNA聚合酶，抑制mRNA轉(zhuǎn)錄而達到殺菌作用；利福平耐藥是由于編碼RNA聚合酶的核心酶的β亞單位的基因ropB發(fā)生突變造成[15]。本研究僅ropB基因突變者22例，531(C→T)是突變頻率最高的位點，與余云芳等[7]報道的湖北省宜昌市、張煒煜等[16]報道的吉林省的檢測結(jié)果一致，是ropB基因突變最常見的突變位點。而異煙肼是通過菌體內(nèi)過氧化氫-過氧化物酶的活化作用，產(chǎn)生自由基攻擊結(jié)核分枝桿菌細胞壁中的分枝菌酸、脂類及DNA等成分，抑制這些成分的合成，破壞細胞壁而產(chǎn)生強大的殺菌效應(yīng)，是全效殺菌劑；但當(dāng)異煙肼相關(guān)katG基因發(fā)生突變會導(dǎo)致異煙肼不能被活化為異煙酸，是異煙肼產(chǎn)生耐藥的主要原因；另外，inhA基因也是異煙肼的作用靶點，異煙肼通過編碼烯?；€原酶使其活化并與inhA酶結(jié)合，阻礙分枝菌酸生化合成途徑，干擾脂酸合成，達到抑菌目的；當(dāng)該基因發(fā)生點突變和堿基或DNA鏈缺失則可使inhA酶過度表達，致所需異煙肼濃度增高，耐藥產(chǎn)生[15]。本研究中，19例異煙肼相關(guān)katG基因和inhA基因中13例發(fā)生katG基因突變，突變頻率最高的位點為315(G→C)，其次為-15(G→T)，與上述作用機制相符，與林淑芳等[17]報道的福建省、余云芳等[7]報道的湖北省宜昌市、張煒煜等[16]報道的吉林省監(jiān)測結(jié)果一致。42例耐利福平和異煙肼患者的基因突變中，40例為雙位點突變，突變頻率最高的是531(C→T)315(G→C)。本研究單耐利福平、單耐異煙肼、耐兩藥的耐藥率分別為5.4%、4.6%、10.2%，以耐兩藥為主，提示我市肺結(jié)核患者多樣、復(fù)雜，與陳求揚等[18]報道的福建省結(jié)核病耐藥監(jiān)測結(jié)果一致，但較余云芳等[7]報道的湖北省宜昌市、張煒煜等[16]報道的吉林省研究結(jié)果更復(fù)雜多樣，說明我院耐藥情況仍較嚴(yán)峻，應(yīng)加強耐利福平和異煙肼患者的個體化治療管理。

由于MDR-TB具有傳染期長、治療時間長、管理難度大、治療效果差、經(jīng)濟負擔(dān)重等特點，導(dǎo)致耐多藥患者成為結(jié)核病的重要傳染源。既往我市對結(jié)核分枝桿菌的研究方法均采用改良羅氏(L-J)培養(yǎng)基進行分離培養(yǎng)、菌種鑒定，采用比例法進行藥物敏感性試驗，需耗時1～3個月，無法滿足臨床對MDR-TB的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的要求[4-5]。本項目研究采用的基因芯片法可在6 h內(nèi)檢出結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群及其對利福平和異煙肼的相關(guān)耐藥基因突變情況，對明確我市MDR-TB疫情有重要意義。建議各縣(市、區(qū))加強實驗室建設(shè)，對肺結(jié)核可疑癥狀者或疑似患者首診時推薦采用分子生物學(xué)方法及時快速檢測出一線抗結(jié)核藥物的藥物敏感性試驗結(jié)果，并結(jié)合耐藥監(jiān)測結(jié)果指導(dǎo)臨床用藥，重點關(guān)注利福平和異煙肼的合理使用，為制定個體化的抗結(jié)核治療方案提供科學(xué)依據(jù)。在治療期間應(yīng)加強全程規(guī)則用藥的督導(dǎo)管理，以提高治療有效性，減少RR-TB和MDR-TB的發(fā)生。