潘鶴立　潘騰飛　佘文琴　徐世榮　李小婷　黃漢唐　陳源　吳少華　潘東明

摘 ?要：為了研究‘琯溪蜜柚果實紅肉突變株系類胡蘿卜素代謝和芽變的分子機制，本研究以‘琯溪蜜柚及其芽變一代品種‘紅肉蜜柚和芽變二代品種‘三紅蜜柚果實為材料，使用RNA-seq技術(shù)研究3個品種3個發(fā)育時期果肉類胡蘿卜素的代謝。經(jīng)生物信息學分析，共篩選出參與類胡蘿卜素生物合成顯著差異表達的10個基因，分別為八氫番茄紅素合成酶基因（PSY）、六氫番茄紅素脫氫酶基因（ZDS）、類胡蘿卜素異構(gòu)酶基因（CRTISO1、CRTISO2）、紫黃質(zhì)脫環(huán)氧酶基因（NPQ1）、9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶基因（NCED3、NCED5）、脫落醛氧化酶基因（AAO3）、ABA 8-羥化酶基因（CYP707A1）、類胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因（CCD4）。共表達分析揭示了7個家族轉(zhuǎn)錄因子的表達模式與類胡蘿卜素合成基因高度相關(guān)，分別為MADS、bZIP、bHLH、MYB、AP2/ERF、NAC和WRKY。通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）驗證了部分基因的表達模式，結(jié)果與RNA-seq結(jié)果高度一致。此外，經(jīng)對‘紅肉蜜柚果肉轉(zhuǎn)色期的初生和次生代謝通路DEGs富集分析，發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素的積累過程中，細胞壁、脂質(zhì)、類黃酮代謝差異基因大量富集。研究結(jié)果揭示，‘琯溪蜜柚果實紅肉突變品種‘紅肉蜜柚和‘三紅蜜柚果實類胡蘿卜素的形成和積累，是由類胡蘿卜素的代謝相關(guān)酶基因差異表達和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控引起的;在果肉紅色芽變的同時，伴隨著與汁胞?；嚓P(guān)的基因突變。這對進一步開展柚子果實類胡蘿卜素的形成與積累、汁胞?；芯浚瑸榻馕鲨止麑嵅煌伾蛔?、汁胞?；臋C制有重要參考價值。

關(guān)鍵詞：琯溪蜜柚;芽變;類胡蘿卜素;轉(zhuǎn)錄組;基因;轉(zhuǎn)錄因子

中圖分類號：S666.3 ? ? ?文獻標識碼：A

Transcriptome Analysis of Carotenoid Metabolism Differential Genes in Pomelo Bud Strain

PAN Heli1， PAN Tengfei1， SHE Wenqin1， XU Shirong1， LI Xiaoting1， HUANG Hantang1， CHEN Yuan2，

WU Shaohua1*， PAN Dongming1*

1. College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China; 2. Institute of Agricultural Engineering and Technology， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China

Abstract： In order to study the molecular mechanism of carotenoid metabolism of ‘Guanximiyou pomelo red mutant line， ‘Guanximiyou pomelo （GX）， its budding first generation ‘Hongroumiyou （HR） and budding second generation ‘Sanhongmiyou （SH） were used to study the carotenoid metabolism in the pulp of the three varieties at three development stages by the RNA SEQ technology. By bioinformatics analysis， 10 differentially expressed genes were isolated to participate in the biosynthesis of carotenoids， namely， PSY， ZDS， CRTISO1/2， NPQ1， and 9-cis-epoxy carotenoids， the genes of oxygenase （NCED3/5）， abscisic aldehyde oxidase （AAO3）， ABA 8-hydroxylase （CYP707A1）， carotenoid cleavage dioxygenases gene （CCD4）. Co expression analysis revealed that the expression patterns of seven family transcription factors were highly correlated with carotenoid synthesis genes， which were MADS， bZIP， bHLH， MYB， AP2/ERF， NAC and WRKY. The expression patterns of some genes were verified by real-time quantitative PCR （qRT-PCR）， and the results were highly consistent with those of RNA-seq. In addition， DEGs enrichment analysis of primary and secondary metabolic pathways in ‘red flesh honey pomelo showed that during the accumulation of carotenoids， genes of cell wall， lipid and flavonoid metabolism were abundant. The results showed that the red flesh mutation of GX was caused by the differential expression of carotenoid metabolism related enzyme genes and the regulation of transcription factors; at the same time， the red bud mutation in flesh was accompanied by the mutation related to juice granulation. This may provide a valuable reference for further study on the formation and accumulation of carotenoids and juice granulation， and also provide a way to analyze the mechanism of different color mutation and juice granulation in pomelo fruit.

2.2 ?差異基因分析

采用P<0.01且| log 2 （FC）|≥2的標準，在3個蜜柚品種的果實發(fā)育過程中進行了unigenes的差異表達分析。由3個品種的不同發(fā)育時期的維恩圖（圖2）可知，3個時期兩兩比對同時差異表達的DEGs，GX、HR和SH分別有619、651和632個，其中最多的是HR，有651個。“80 d vs. 120 d”與“120 d vs. 180 d”同時差異表達的基因中，HR和SH均遠多于GX，差距300多個，說明這些基因可能與類胡蘿卜素代謝相關(guān)。通過比較發(fā)現(xiàn)了許多差異表達的基因（表2）。

2.3 ?差異表達基因的功能注釋和分析

為了確定和注釋3個蜜柚品種的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對差異表達基因與NR，Swiss-Prot，GO，COG，KOG，Pfam和KEGG這7個數(shù)據(jù)庫進行功能注釋，發(fā)現(xiàn)HR果肉在80 d和180 d之間注釋富集到了最多的KEGG，共1317條。3個蜜柚品種芽變的性狀是由次級代謝中的類胡蘿卜素決定的，進一步對次級代謝中的主要KEGG進行差異基因數(shù)目的統(tǒng)計（圖3），發(fā)現(xiàn)在苯丙烷生物合成途徑差異基因最多，在GX、HR和SH 3個品種果實中分別有63、66和68個，其次是黃酮類合成途徑，在類胡蘿卜素代謝途徑中分別有8、9、10個。苯丙烷、黃酮類代謝均與木質(zhì)素合成關(guān)系密切，與汁胞?；芮邢嚓P(guān);且黃酮類代謝還與類胡蘿卜素代謝相關(guān)。說明‘琯溪蜜柚果肉紅色芽變還伴隨著與汁胞粒化相關(guān)的突變，這與‘紅肉蜜柚‘三紅蜜柚2個芽變品種較‘琯溪蜜柚容易發(fā)生汁胞粒化癥相符合。

2.4 ?類胡蘿卜素代謝分析

為了進一步探究參與類胡蘿卜素生物合成的基因，分析了不同發(fā)育階段3個蜜柚品種的轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)，分離了編碼與類胡蘿卜素生物合成途徑相關(guān)酶的基因（表3），并根據(jù)差異基因的表達量，在類胡蘿卜素代謝途徑中進行標注（圖4），可見3個蜜柚品種類胡蘿卜素的代謝有明顯的差異。

為了鑒定3個蜜柚品種差異表達的轉(zhuǎn)錄因子，利用百邁客云平臺（www.biocloud.net）預測柚子中的所有轉(zhuǎn)錄因子，與所有差異基因取交集發(fā)現(xiàn)其中具有差異表達的轉(zhuǎn)錄因子共有570個，來自51個不同家族。用spearman方法計算類胡蘿卜素生物合成途徑的功能基因與轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)性，設置相關(guān)性系數(shù)閾值為大于0.73或者小于?0.73，且至少有一個FKPM大于等于10（排除假陽性），得到的轉(zhuǎn)錄因子共有205個。又分別篩選每個功能基因正負相關(guān)性最大的5個基因進行分析，最終得到與類胡蘿卜素代謝高度相關(guān)的候選轉(zhuǎn)錄因子71個，分布在27個不同家族。其中，包括7個與類胡蘿卜素代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族，為MADS、bZIP、bHLH、MYB、AP2/ERF、NAC和WRKY（圖5）。在圖5中，有大片區(qū)域展

示藍色，說明該區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子對類胡蘿卜素合成基因為負調(diào)控作用;紅色區(qū)域說明處于這一塊區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子對類胡蘿卜素合成基因為正調(diào)控作用。如Cg4g002330對CYP707A1顯著正相關(guān)，與NCED5、ZDS顯著負相關(guān)，與CRTISO2極顯著負相關(guān)。

此外，由圖6可知，類胡蘿卜素代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，在3個蜜柚品種和3個時期的表達趨勢各異。

2.5 ?‘紅肉蜜柚果實轉(zhuǎn)色期的初生和次級代謝分析

果實發(fā)育是一個代謝物積累、轉(zhuǎn)運和降解的過程。類胡蘿卜素代謝只是次級代謝中的一種，離不開其它代謝過程的相互作用?！t肉蜜柚是‘琯溪蜜柚的芽變品種，在果實成熟過程，果肉從白色突變?yōu)榧t色，是研究類胡蘿卜素與其他代謝途徑協(xié)同關(guān)系的重要材料。經(jīng)‘紅肉蜜柚果實轉(zhuǎn)色期的初生和次生代謝通路DEGs富集分析，發(fā)現(xiàn)在類胡蘿卜素積累的過程中，差異基因富集最多的是細胞壁代謝、脂質(zhì)代謝、次生代謝途徑，其次是糖代謝、抗壞血酸和谷胱甘肽等一些代謝途徑。其中，細胞壁代謝途徑差異表達最多的是纖維素合成、果膠甲脂酶、果膠酸裂解酶和多聚半乳糖醛酸酶基因;在糖代謝途徑中，淀粉降解加快，蔗糖合成加快，蔗糖降解減慢，符合果實成熟發(fā)育的特征;抗壞血酸和谷胱甘肽代謝的基因多數(shù)上調(diào)表達;次級代謝途徑中，類胡蘿卜素代謝的上游代謝途徑類黃酮代謝中差異表達基因數(shù)最多，與類胡蘿卜素代謝關(guān)系較為密切。

這一結(jié)果再次表明，在果肉紅色芽變果肉中類胡蘿卜素代謝相關(guān)基因差異表達的同時，伴隨著與汁胞?；嚓P(guān)基因的差異表達。

2.6 ?qRT-PCR驗證

為了進一步證實轉(zhuǎn)錄組學分析的結(jié)果，選擇了10個類胡蘿卜素合成的差異表達基因，以及18個與類胡蘿卜素代謝極顯著（P<0.01）相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，通過qRT-PCR在3個蜜柚品種中分析了10個與類胡蘿卜素生物合成相關(guān)的基因。如圖7所示，所有選擇的基因在3個階段中以不同水平表達，并且與RNA-seq數(shù)據(jù)具有緊密相關(guān)性。

根據(jù)qRT-PCR結(jié)果（圖7），HR和SH 3個時期果實的ZDS和CRTISO2基因的表達均高于GX，可能是HR和SH積累番茄紅素的關(guān)鍵因素。CCD4對應擬南芥中的AtCCD4（AT4G19170.1），GX果肉中的表達量從80 d到180 d下降了約2倍，而HR上升了約1.5倍，說明CCD4可能在蜜柚果肉中調(diào)控番茄紅素的降解。AAO3在不同蜜柚品種中隨著果實的成熟而下降，說明到成熟后期內(nèi)源ABA合成迅速減慢。CYP707A1在HR和SH中呈先升高后降低的趨勢，而GX則隨著成熟不斷升高。這可能涉及在果實成熟后期降低ABA含量防止其過度積累，從而使果實生命活動趨于穩(wěn)定。因此，推測ABA的合成受類胡蘿卜素的含量和組分的調(diào)控，同時，ABA也參與調(diào)控果實成熟及類胡蘿卜素的反饋調(diào)節(jié)。MYB5、WRKY1、MADS1、MADS2和WRKY2在GX的3個發(fā)育時期的差異表達是3個品種中最顯著的。MYB3在80 d時在SH中的表達量最高，隨著果實發(fā)育迅速下降。轉(zhuǎn)錄因子NAC3在GX 3個發(fā)育時期的果實中的表達量逐漸上升，在HR和SH的80 d與120 d時期保持一定的表達量，在180 d時表達量增大1倍，而NAC4則呈現(xiàn)逐漸下降后期回升的趨勢。轉(zhuǎn)錄因子ZIP1、ZIP2、BHLH1和BHLH2在3個品種中則都隨著果實發(fā)育而下降。

3 ?討論

類胡蘿卜素是柚類水果中最主要的紅色色素。類胡蘿卜素的組成組分與代謝積累是影響果實顏色呈色的主要原因，不同的類胡蘿卜素組分使得果實顏色表現(xiàn)出黃色到紫紅色的變化。前期研究已經(jīng)證明，‘琯溪蜜柚的紅色突變品種‘紅肉蜜柚和‘三紅蜜柚，果肉中主要積累番茄紅素和β-胡蘿卜素[1-4， 6-9]。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，‘紅肉蜜柚和‘三紅蜜柚3個不同時期果實的ZDS和CRTISO2基因的表達均高于‘琯溪蜜柚。前人研究表明，八氫番茄紅素合酶基因（PSY）、六氫番茄紅素脫氫酶基因（ZDS）、類胡蘿卜素異構(gòu)酶基因（CRTISO）、紫黃質(zhì)脫環(huán)氧酶（NPQ）、9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（NCED）在類胡蘿卜素生物合成中，可能是控制類胡蘿卜素代謝的關(guān)鍵因素[2，3，8，10]。另有研究報道，分別從番茄和擬南芥中分離和鑒定得到了類胡蘿卜素異構(gòu)酶（CRTISO）基因，并確認了在植物體內(nèi)由八氫番茄紅素轉(zhuǎn)化番茄紅素是PDS、ZDS和CRTISO三個酶基因共同作用的結(jié)果[11-12]。由此可見，ZDS和CRTISO2基因的上調(diào)表達是‘琯溪蜜柚紅肉突變體‘紅肉蜜柚和‘三紅蜜柚積累番茄紅素的關(guān)鍵因素。

‘琯溪蜜柚果肉中的CCD4表達量從花后80 d到180 d下調(diào)了約2倍，而‘紅肉蜜柚上調(diào)了約1.5倍。有研究證實，CCD4酶是編碼具有9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)，作用于多種類胡蘿卜素，包括β-胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃質(zhì)和全反式-紫黃質(zhì)。在不同植物不同組織中對類胡蘿卜素具有調(diào)控作用，如擬南芥種子[13]、菊花瓣[14]和桃果肉[15-16]。柑橘中的CCD4酶通過切割β-胡蘿卜素、β-隱黃質(zhì)和玉米黃質(zhì)中的C7-C8雙鍵，從而調(diào)控果皮色素、β-柑橘苷、β-檸檬醛以及揮發(fā)物等[17-19]。已經(jīng)證實9-順式- 環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶NECD對順式-環(huán)氧類胡蘿卜素的氧化裂解是高等植物中ABA合成調(diào)節(jié)的關(guān)鍵步驟[20]。說明CCD4可能在蜜柚果肉中調(diào)控著番茄紅素的積累。

本研究結(jié)果表明，在不同蜜柚品種中AAO3隨著果實的成熟而下降，說明到果實成熟后期內(nèi)源ABA合成減慢。已有研究表明，水果中ABA含量的調(diào)節(jié)是由兩種主要的代謝酶基因AAO3和CYP707A1調(diào)控的[21]。外源ABA處理，可以顯著影響杧果[22]、葡萄[23-24]、西瓜[25]等水果類胡蘿卜素含量的積累。同樣，參與類胡蘿卜素代謝的幾個重要基因，如來自玉米的PSY3和來自水稻的β-胡蘿卜素羥化酶基因DSM2，都被ABA處理顯著誘導[12， 26]。這些結(jié)果表明，ABA既是類胡蘿卜素途徑的下游產(chǎn)物，同時也是類胡蘿卜素代謝的反饋調(diào)節(jié)劑。在本研究中觀測到，CYP707A1在‘紅肉蜜柚和‘三紅蜜柚果實中，呈先上調(diào)而后下調(diào)的趨勢，而‘琯溪蜜柚則隨著成熟不斷升高。因此，推測ABA的合成受類胡蘿卜素的含量和組分的調(diào)控，同時，ABA也參與調(diào)控果實成熟及類胡蘿卜素的反饋調(diào)節(jié)。

本研究篩選到18個與類胡蘿卜素合成基因顯著相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，其家族分別為9個AP2/ERF、4個bHLH、3個bZIP、3個MADS-box、7個MYB、5個NAC和5個WRKY。已有研究報道了一些轉(zhuǎn)錄因子可能調(diào)控類胡蘿卜素代謝，如擬南芥中的PIF1和RAP2.2（AP2/ERF家族）[27-28];西瓜中的ERF6等[29];紅薯中的NAC、MYB、AP2/ERF、WRKY、bZIP和ARF等[30]。在番茄中，沉默SlNAC4不僅延遲果實成熟同時導致類胡蘿卜素含量減少，說明SlNAC4是類胡蘿卜素和成熟的正調(diào)控因子[30]。將葡萄中的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子（VvMYB5b）轉(zhuǎn)入番茄中，發(fā)現(xiàn)苯丙烷代謝下調(diào)，而β-胡蘿卜素的量上調(diào)，證明了這2條途徑都受到調(diào)控并可以獨自代謝[31]。而在柑橘突變體（Citrus reticulata cv Suavissima）中，也發(fā)現(xiàn)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子（CrMYB68）通過負調(diào)控CrBCH2和CrNCED5的表達，從而調(diào)控α-和β-分支類胡蘿卜素的轉(zhuǎn)化[32]。共表達分析表明，本研究篩選到的轉(zhuǎn)錄因子與類胡蘿卜素合成基因具有顯著相關(guān)，有些同時與多個類胡蘿卜素合成基因具有顯著相關(guān)性。

綜上所述，本研究初步鑒定了一批與蜜柚類胡蘿卜素代謝相關(guān)的功能基因和轉(zhuǎn)錄因子。研究結(jié)果揭示，‘琯溪蜜柚果實紅肉突變品種‘紅肉蜜柚和‘三紅蜜柚果實類胡蘿卜素的形成和積累，是由類胡蘿卜素的代謝相關(guān)酶基因差異表達和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控引起的;在果肉紅色芽變的同時，伴隨著與汁胞粒化相關(guān)的基因突變。誠然，這些功能基因的功能已有較多的研究，作用已經(jīng)逐漸清晰，但是調(diào)控它們的轉(zhuǎn)錄因子目前研究的還很少，特別是多年生果樹柑橘，由于童期太長，研究進展相對緩慢。因此，這些被鑒定的轉(zhuǎn)錄因子，是如何與靶基因相互作用而實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的;是如何影響蛋白修飾如組蛋白磷酸化、甲基化和乙酰化，從而導致不同的調(diào)控途徑發(fā)揮不同作用的，都尚不清楚。這些調(diào)控機理尚待進一步研究，為揭示柚類等柑橘的類胡蘿卜素調(diào)控和果實顏色芽變機理提供理論支持。

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收稿日期 ?2020-04-24;修回日期 ?2020-07-16

基金項目 ?2017年福建省科技廳區(qū)域發(fā)展項目（No. 2017N3005）;2018年福建省發(fā)改委農(nóng)業(yè)“五新”工程項目（閩發(fā)改農(nóng)業(yè)[2018]114號）;福建省農(nóng)業(yè)科學院“青年科技英才百人計劃”項目（No. YC2015-10）。

作者簡介 ?潘鶴立（1983—），男，博士，講師，研究方向：園藝學。*通信作者（Corresponding author）：吳少華（WU Shaohua），E-mail：348279953@qq.com;潘東明（PAN Dongming），E-mail：pdm666@126.com。