潘鶴立　潘騰飛　佘文琴　徐世榮　李小婷　黃漢唐　陳源　吳少華　潘東明

摘 ?要：為了研究‘琯溪蜜柚果實(shí)紅肉突變株系類胡蘿卜素代謝和芽變的分子機(jī)制，本研究以‘琯溪蜜柚及其芽變一代品種‘紅肉蜜柚和芽變二代品種‘三紅蜜柚果實(shí)為材料，使用RNA-seq技術(shù)研究3個(gè)品種3個(gè)發(fā)育時(shí)期果肉類胡蘿卜素的代謝。經(jīng)生物信息學(xué)分析，共篩選出參與類胡蘿卜素生物合成顯著差異表達(dá)的10個(gè)基因，分別為八氫番茄紅素合成酶基因（PSY）、六氫番茄紅素脫氫酶基因（ZDS）、類胡蘿卜素異構(gòu)酶基因（CRTISO1、CRTISO2）、紫黃質(zhì)脫環(huán)氧酶基因（NPQ1）、9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶基因（NCED3、NCED5）、脫落醛氧化酶基因（AAO3）、ABA 8-羥化酶基因（CYP707A1）、類胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因（CCD4）。共表達(dá)分析揭示了7個(gè)家族轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)模式與類胡蘿卜素合成基因高度相關(guān)，分別為MADS、bZIP、bHLH、MYB、AP2/ERF、NAC和WRKY。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）驗(yàn)證了部分基因的表達(dá)模式，結(jié)果與RNA-seq結(jié)果高度一致。此外，經(jīng)對(duì)‘紅肉蜜柚果肉轉(zhuǎn)色期的初生和次生代謝通路DEGs富集分析，發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素的積累過(guò)程中，細(xì)胞壁、脂質(zhì)、類黃酮代謝差異基因大量富集。研究結(jié)果揭示，‘琯溪蜜柚果實(shí)紅肉突變品種‘紅肉蜜柚和‘三紅蜜柚果實(shí)類胡蘿卜素的形成和積累，是由類胡蘿卜素的代謝相關(guān)酶基因差異表達(dá)和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控引起的;在果肉紅色芽變的同時(shí)，伴隨著與汁胞?；嚓P(guān)的基因突變。這對(duì)進(jìn)一步開(kāi)展柚子果實(shí)類胡蘿卜素的形成與積累、汁胞?；芯?，為解析柚果實(shí)不同顏色突變、汁胞?；臋C(jī)制有重要參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞：琯溪蜜柚;芽變;類胡蘿卜素;轉(zhuǎn)錄組;基因;轉(zhuǎn)錄因子

中圖分類號(hào)：S666.3 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Transcriptome Analysis of Carotenoid Metabolism Differential Genes in Pomelo Bud Strain

PAN Heli1， PAN Tengfei1， SHE Wenqin1， XU Shirong1， LI Xiaoting1， HUANG Hantang1， CHEN Yuan2，

WU Shaohua1*， PAN Dongming1*

1. College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China; 2. Institute of Agricultural Engineering and Technology， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China

Abstract： In order to study the molecular mechanism of carotenoid metabolism of ‘Guanximiyou pomelo red mutant line， ‘Guanximiyou pomelo （GX）， its budding first generation ‘Hongroumiyou （HR） and budding second generation ‘Sanhongmiyou （SH） were used to study the carotenoid metabolism in the pulp of the three varieties at three development stages by the RNA SEQ technology. By bioinformatics analysis， 10 differentially expressed genes were isolated to participate in the biosynthesis of carotenoids， namely， PSY， ZDS， CRTISO1/2， NPQ1， and 9-cis-epoxy carotenoids， the genes of oxygenase （NCED3/5）， abscisic aldehyde oxidase （AAO3）， ABA 8-hydroxylase （CYP707A1）， carotenoid cleavage dioxygenases gene （CCD4）. Co expression analysis revealed that the expression patterns of seven family transcription factors were highly correlated with carotenoid synthesis genes， which were MADS， bZIP， bHLH， MYB， AP2/ERF， NAC and WRKY. The expression patterns of some genes were verified by real-time quantitative PCR （qRT-PCR）， and the results were highly consistent with those of RNA-seq. In addition， DEGs enrichment analysis of primary and secondary metabolic pathways in ‘red flesh honey pomelo showed that during the accumulation of carotenoids， genes of cell wall， lipid and flavonoid metabolism were abundant. The results showed that the red flesh mutation of GX was caused by the differential expression of carotenoid metabolism related enzyme genes and the regulation of transcription factors; at the same time， the red bud mutation in flesh was accompanied by the mutation related to juice granulation. This may provide a valuable reference for further study on the formation and accumulation of carotenoids and juice granulation， and also provide a way to analyze the mechanism of different color mutation and juice granulation in pomelo fruit.

2.2 ?差異基因分析

采用P<0.01且| log 2 （FC）|≥2的標(biāo)準(zhǔn)，在3個(gè)蜜柚品種的果實(shí)發(fā)育過(guò)程中進(jìn)行了unigenes的差異表達(dá)分析。由3個(gè)品種的不同發(fā)育時(shí)期的維恩圖（圖2）可知，3個(gè)時(shí)期兩兩比對(duì)同時(shí)差異表達(dá)的DEGs，GX、HR和SH分別有619、651和632個(gè)，其中最多的是HR，有651個(gè)?！?0 d vs. 120 d”與“120 d vs. 180 d”同時(shí)差異表達(dá)的基因中，HR和SH均遠(yuǎn)多于GX，差距300多個(gè)，說(shuō)明這些基因可能與類胡蘿卜素代謝相關(guān)。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)了許多差異表達(dá)的基因（表2）。

2.3 ?差異表達(dá)基因的功能注釋和分析

為了確定和注釋3個(gè)蜜柚品種的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)差異表達(dá)基因與NR，Swiss-Prot，GO，COG，KOG，Pfam和KEGG這7個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能注釋，發(fā)現(xiàn)HR果肉在80 d和180 d之間注釋富集到了最多的KEGG，共1317條。3個(gè)蜜柚品種芽變的性狀是由次級(jí)代謝中的類胡蘿卜素決定的，進(jìn)一步對(duì)次級(jí)代謝中的主要KEGG進(jìn)行差異基因數(shù)目的統(tǒng)計(jì)（圖3），發(fā)現(xiàn)在苯丙烷生物合成途徑差異基因最多，在GX、HR和SH 3個(gè)品種果實(shí)中分別有63、66和68個(gè)，其次是黃酮類合成途徑，在類胡蘿卜素代謝途徑中分別有8、9、10個(gè)。苯丙烷、黃酮類代謝均與木質(zhì)素合成關(guān)系密切，與汁胞?；芮邢嚓P(guān);且黃酮類代謝還與類胡蘿卜素代謝相關(guān)。說(shuō)明‘琯溪蜜柚果肉紅色芽變還伴隨著與汁胞?；嚓P(guān)的突變，這與‘紅肉蜜柚‘三紅蜜柚2個(gè)芽變品種較‘琯溪蜜柚容易發(fā)生汁胞?；Y相符合。

2.4 ?類胡蘿卜素代謝分析

為了進(jìn)一步探究參與類胡蘿卜素生物合成的基因，分析了不同發(fā)育階段3個(gè)蜜柚品種的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，分離了編碼與類胡蘿卜素生物合成途徑相關(guān)酶的基因（表3），并根據(jù)差異基因的表達(dá)量，在類胡蘿卜素代謝途徑中進(jìn)行標(biāo)注（圖4），可見(jiàn)3個(gè)蜜柚品種類胡蘿卜素的代謝有明顯的差異。

為了鑒定3個(gè)蜜柚品種差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，利用百邁客云平臺(tái)（www.biocloud.net）預(yù)測(cè)柚子中的所有轉(zhuǎn)錄因子，與所有差異基因取交集發(fā)現(xiàn)其中具有差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子共有570個(gè)，來(lái)自51個(gè)不同家族。用spearman方法計(jì)算類胡蘿卜素生物合成途徑的功能基因與轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)性，設(shè)置相關(guān)性系數(shù)閾值為大于0.73或者小于?0.73，且至少有一個(gè)FKPM大于等于10（排除假陽(yáng)性），得到的轉(zhuǎn)錄因子共有205個(gè)。又分別篩選每個(gè)功能基因正負(fù)相關(guān)性最大的5個(gè)基因進(jìn)行分析，最終得到與類胡蘿卜素代謝高度相關(guān)的候選轉(zhuǎn)錄因子71個(gè)，分布在27個(gè)不同家族。其中，包括7個(gè)與類胡蘿卜素代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族，為MADS、bZIP、bHLH、MYB、AP2/ERF、NAC和WRKY（圖5）。在圖5中，有大片區(qū)域展

示藍(lán)色，說(shuō)明該區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子對(duì)類胡蘿卜素合成基因?yàn)樨?fù)調(diào)控作用;紅色區(qū)域說(shuō)明處于這一塊區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子對(duì)類胡蘿卜素合成基因?yàn)檎{(diào)控作用。如Cg4g002330對(duì)CYP707A1顯著正相關(guān)，與NCED5、ZDS顯著負(fù)相關(guān)，與CRTISO2極顯著負(fù)相關(guān)。

此外，由圖6可知，類胡蘿卜素代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，在3個(gè)蜜柚品種和3個(gè)時(shí)期的表達(dá)趨勢(shì)各異。

2.5 ?‘紅肉蜜柚果實(shí)轉(zhuǎn)色期的初生和次級(jí)代謝分析

果實(shí)發(fā)育是一個(gè)代謝物積累、轉(zhuǎn)運(yùn)和降解的過(guò)程。類胡蘿卜素代謝只是次級(jí)代謝中的一種，離不開(kāi)其它代謝過(guò)程的相互作用?！t肉蜜柚是‘琯溪蜜柚的芽變品種，在果實(shí)成熟過(guò)程，果肉從白色突變?yōu)榧t色，是研究類胡蘿卜素與其他代謝途徑協(xié)同關(guān)系的重要材料。經(jīng)‘紅肉蜜柚果實(shí)轉(zhuǎn)色期的初生和次生代謝通路DEGs富集分析，發(fā)現(xiàn)在類胡蘿卜素積累的過(guò)程中，差異基因富集最多的是細(xì)胞壁代謝、脂質(zhì)代謝、次生代謝途徑，其次是糖代謝、抗壞血酸和谷胱甘肽等一些代謝途徑。其中，細(xì)胞壁代謝途徑差異表達(dá)最多的是纖維素合成、果膠甲脂酶、果膠酸裂解酶和多聚半乳糖醛酸酶基因;在糖代謝途徑中，淀粉降解加快，蔗糖合成加快，蔗糖降解減慢，符合果實(shí)成熟發(fā)育的特征;抗壞血酸和谷胱甘肽代謝的基因多數(shù)上調(diào)表達(dá);次級(jí)代謝途徑中，類胡蘿卜素代謝的上游代謝途徑類黃酮代謝中差異表達(dá)基因數(shù)最多，與類胡蘿卜素代謝關(guān)系較為密切。

這一結(jié)果再次表明，在果肉紅色芽變果肉中類胡蘿卜素代謝相關(guān)基因差異表達(dá)的同時(shí)，伴隨著與汁胞粒化相關(guān)基因的差異表達(dá)。

2.6 ?qRT-PCR驗(yàn)證

為了進(jìn)一步證實(shí)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的結(jié)果，選擇了10個(gè)類胡蘿卜素合成的差異表達(dá)基因，以及18個(gè)與類胡蘿卜素代謝極顯著（P<0.01）相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)qRT-PCR在3個(gè)蜜柚品種中分析了10個(gè)與類胡蘿卜素生物合成相關(guān)的基因。如圖7所示，所有選擇的基因在3個(gè)階段中以不同水平表達(dá)，并且與RNA-seq數(shù)據(jù)具有緊密相關(guān)性。

根據(jù)qRT-PCR結(jié)果（圖7），HR和SH 3個(gè)時(shí)期果實(shí)的ZDS和CRTISO2基因的表達(dá)均高于GX，可能是HR和SH積累番茄紅素的關(guān)鍵因素。CCD4對(duì)應(yīng)擬南芥中的AtCCD4（AT4G19170.1），GX果肉中的表達(dá)量從80 d到180 d下降了約2倍，而HR上升了約1.5倍，說(shuō)明CCD4可能在蜜柚果肉中調(diào)控番茄紅素的降解。AAO3在不同蜜柚品種中隨著果實(shí)的成熟而下降，說(shuō)明到成熟后期內(nèi)源ABA合成迅速減慢。CYP707A1在HR和SH中呈先升高后降低的趨勢(shì)，而GX則隨著成熟不斷升高。這可能涉及在果實(shí)成熟后期降低ABA含量防止其過(guò)度積累，從而使果實(shí)生命活動(dòng)趨于穩(wěn)定。因此，推測(cè)ABA的合成受類胡蘿卜素的含量和組分的調(diào)控，同時(shí)，ABA也參與調(diào)控果實(shí)成熟及類胡蘿卜素的反饋調(diào)節(jié)。MYB5、WRKY1、MADS1、MADS2和WRKY2在GX的3個(gè)發(fā)育時(shí)期的差異表達(dá)是3個(gè)品種中最顯著的。MYB3在80 d時(shí)在SH中的表達(dá)量最高，隨著果實(shí)發(fā)育迅速下降。轉(zhuǎn)錄因子NAC3在GX 3個(gè)發(fā)育時(shí)期的果實(shí)中的表達(dá)量逐漸上升，在HR和SH的80 d與120 d時(shí)期保持一定的表達(dá)量，在180 d時(shí)表達(dá)量增大1倍，而NAC4則呈現(xiàn)逐漸下降后期回升的趨勢(shì)。轉(zhuǎn)錄因子ZIP1、ZIP2、BHLH1和BHLH2在3個(gè)品種中則都隨著果實(shí)發(fā)育而下降。

3 ?討論

類胡蘿卜素是柚類水果中最主要的紅色色素。類胡蘿卜素的組成組分與代謝積累是影響果實(shí)顏色呈色的主要原因，不同的類胡蘿卜素組分使得果實(shí)顏色表現(xiàn)出黃色到紫紅色的變化。前期研究已經(jīng)證明，‘琯溪蜜柚的紅色突變品種‘紅肉蜜柚和‘三紅蜜柚，果肉中主要積累番茄紅素和β-胡蘿卜素[1-4， 6-9]。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，‘紅肉蜜柚和‘三紅蜜柚3個(gè)不同時(shí)期果實(shí)的ZDS和CRTISO2基因的表達(dá)均高于‘琯溪蜜柚。前人研究表明，八氫番茄紅素合酶基因（PSY）、六氫番茄紅素脫氫酶基因（ZDS）、類胡蘿卜素異構(gòu)酶基因（CRTISO）、紫黃質(zhì)脫環(huán)氧酶（NPQ）、9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（NCED）在類胡蘿卜素生物合成中，可能是控制類胡蘿卜素代謝的關(guān)鍵因素[2，3，8，10]。另有研究報(bào)道，分別從番茄和擬南芥中分離和鑒定得到了類胡蘿卜素異構(gòu)酶（CRTISO）基因，并確認(rèn)了在植物體內(nèi)由八氫番茄紅素轉(zhuǎn)化番茄紅素是PDS、ZDS和CRTISO三個(gè)酶基因共同作用的結(jié)果[11-12]。由此可見(jiàn)，ZDS和CRTISO2基因的上調(diào)表達(dá)是‘琯溪蜜柚紅肉突變體‘紅肉蜜柚和‘三紅蜜柚積累番茄紅素的關(guān)鍵因素。

‘琯溪蜜柚果肉中的CCD4表達(dá)量從花后80 d到180 d下調(diào)了約2倍，而‘紅肉蜜柚上調(diào)了約1.5倍。有研究證實(shí)，CCD4酶是編碼具有9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)，作用于多種類胡蘿卜素，包括β-胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃質(zhì)和全反式-紫黃質(zhì)。在不同植物不同組織中對(duì)類胡蘿卜素具有調(diào)控作用，如擬南芥種子[13]、菊花瓣[14]和桃果肉[15-16]。柑橘中的CCD4酶通過(guò)切割β-胡蘿卜素、β-隱黃質(zhì)和玉米黃質(zhì)中的C7-C8雙鍵，從而調(diào)控果皮色素、β-柑橘苷、β-檸檬醛以及揮發(fā)物等[17-19]。已經(jīng)證實(shí)9-順式- 環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶NECD對(duì)順式-環(huán)氧類胡蘿卜素的氧化裂解是高等植物中ABA合成調(diào)節(jié)的關(guān)鍵步驟[20]。說(shuō)明CCD4可能在蜜柚果肉中調(diào)控著番茄紅素的積累。

本研究結(jié)果表明，在不同蜜柚品種中AAO3隨著果實(shí)的成熟而下降，說(shuō)明到果實(shí)成熟后期內(nèi)源ABA合成減慢。已有研究表明，水果中ABA含量的調(diào)節(jié)是由兩種主要的代謝酶基因AAO3和CYP707A1調(diào)控的[21]。外源ABA處理，可以顯著影響杧果[22]、葡萄[23-24]、西瓜[25]等水果類胡蘿卜素含量的積累。同樣，參與類胡蘿卜素代謝的幾個(gè)重要基因，如來(lái)自玉米的PSY3和來(lái)自水稻的β-胡蘿卜素羥化酶基因DSM2，都被ABA處理顯著誘導(dǎo)[12， 26]。這些結(jié)果表明，ABA既是類胡蘿卜素途徑的下游產(chǎn)物，同時(shí)也是類胡蘿卜素代謝的反饋調(diào)節(jié)劑。在本研究中觀測(cè)到，CYP707A1在‘紅肉蜜柚和‘三紅蜜柚果實(shí)中，呈先上調(diào)而后下調(diào)的趨勢(shì)，而‘琯溪蜜柚則隨著成熟不斷升高。因此，推測(cè)ABA的合成受類胡蘿卜素的含量和組分的調(diào)控，同時(shí)，ABA也參與調(diào)控果實(shí)成熟及類胡蘿卜素的反饋調(diào)節(jié)。

本研究篩選到18個(gè)與類胡蘿卜素合成基因顯著相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，其家族分別為9個(gè)AP2/ERF、4個(gè)bHLH、3個(gè)bZIP、3個(gè)MADS-box、7個(gè)MYB、5個(gè)NAC和5個(gè)WRKY。已有研究報(bào)道了一些轉(zhuǎn)錄因子可能調(diào)控類胡蘿卜素代謝，如擬南芥中的PIF1和RAP2.2（AP2/ERF家族）[27-28];西瓜中的ERF6等[29];紅薯中的NAC、MYB、AP2/ERF、WRKY、bZIP和ARF等[30]。在番茄中，沉默SlNAC4不僅延遲果實(shí)成熟同時(shí)導(dǎo)致類胡蘿卜素含量減少，說(shuō)明SlNAC4是類胡蘿卜素和成熟的正調(diào)控因子[30]。將葡萄中的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子（VvMYB5b）轉(zhuǎn)入番茄中，發(fā)現(xiàn)苯丙烷代謝下調(diào)，而β-胡蘿卜素的量上調(diào)，證明了這2條途徑都受到調(diào)控并可以獨(dú)自代謝[31]。而在柑橘突變體（Citrus reticulata cv Suavissima）中，也發(fā)現(xiàn)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子（CrMYB68）通過(guò)負(fù)調(diào)控CrBCH2和CrNCED5的表達(dá)，從而調(diào)控α-和β-分支類胡蘿卜素的轉(zhuǎn)化[32]。共表達(dá)分析表明，本研究篩選到的轉(zhuǎn)錄因子與類胡蘿卜素合成基因具有顯著相關(guān)，有些同時(shí)與多個(gè)類胡蘿卜素合成基因具有顯著相關(guān)性。

綜上所述，本研究初步鑒定了一批與蜜柚類胡蘿卜素代謝相關(guān)的功能基因和轉(zhuǎn)錄因子。研究結(jié)果揭示，‘琯溪蜜柚果實(shí)紅肉突變品種‘紅肉蜜柚和‘三紅蜜柚果實(shí)類胡蘿卜素的形成和積累，是由類胡蘿卜素的代謝相關(guān)酶基因差異表達(dá)和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控引起的;在果肉紅色芽變的同時(shí)，伴隨著與汁胞?；嚓P(guān)的基因突變。誠(chéng)然，這些功能基因的功能已有較多的研究，作用已經(jīng)逐漸清晰，但是調(diào)控它們的轉(zhuǎn)錄因子目前研究的還很少，特別是多年生果樹柑橘，由于童期太長(zhǎng)，研究進(jìn)展相對(duì)緩慢。因此，這些被鑒定的轉(zhuǎn)錄因子，是如何與靶基因相互作用而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的;是如何影響蛋白修飾如組蛋白磷酸化、甲基化和乙酰化，從而導(dǎo)致不同的調(diào)控途徑發(fā)揮不同作用的，都尚不清楚。這些調(diào)控機(jī)理尚待進(jìn)一步研究，為揭示柚類等柑橘的類胡蘿卜素調(diào)控和果實(shí)顏色芽變機(jī)理提供理論支持。

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收稿日期 ?2020-04-24;修回日期 ?2020-07-16

基金項(xiàng)目 ?2017年福建省科技廳區(qū)域發(fā)展項(xiàng)目（No. 2017N3005）;2018年福建省發(fā)改委農(nóng)業(yè)“五新”工程項(xiàng)目（閩發(fā)改農(nóng)業(yè)[2018]114號(hào)）;福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院“青年科技英才百人計(jì)劃”項(xiàng)目（No. YC2015-10）。

作者簡(jiǎn)介 ?潘鶴立（1983—），男，博士，講師，研究方向：園藝學(xué)。*通信作者（Corresponding author）：吳少華（WU Shaohua），E-mail：348279953@qq.com;潘東明（PAN Dongming），E-mail：pdm666@126.com。