武廣珩，傅仙玉，陳志賓

（1.福建省生態(tài)產(chǎn)業(yè)綠色技術(shù)重點實驗室，福建武夷山354300；2.武夷學院生態(tài)與資源工程學院，福建武夷山354300；3.武夷學院茶與食品學院，福建武夷山354300；4.中國烏龍茶產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，福建武夷山 354300；）

番茄紅素廣泛存在于一些植物中，如百香果、番茄、草莓、胡蘿卜、番茄等，是一種較為常見的功能性色素，它屬于類胡蘿卜素中的一種[1]。番茄紅素是一種脂溶性有機化合物，易溶于有機溶劑，難溶于水，分子式為C40H56，分子量為536.85 Da，具有11 個共軛雙鍵和2 個非共軛碳-碳雙鍵[2]。番茄紅素是目前在自然界中發(fā)現(xiàn)的最強的抗氧化劑，它的抗氧化能力比β-胡蘿卜素強2 倍以上，比維生素E 強100 倍[3]，還具有消除人體自由基，延緩衰老的作用，因此又有“植物黃金”的美譽[4]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)番茄紅素能夠有效的預(yù)防心血管疾病，對動脈粥樣硬化具有延緩作用，能夠提高人體的免疫力[5-6]。同時對于多種癌癥具有一定的治療效果[7-8]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，番茄紅素通過增強干擾素途徑提高了PD-1 單抗的治療效果[9]。番茄紅素以其極高的藥用價值，被認定為A 類營養(yǎng)素，是世界公認的集營養(yǎng)與著色雙重作用于一體的功能性食品添加劑[10]。

對于番茄紅素的提取方法，王藝璇等[11]對其進行總結(jié)，主要有如下幾種方法：一是有機溶劑浸提法，其利用的是番茄紅素為脂溶性色素，可溶于脂溶性的有機溶劑中，通過選擇最佳的有機提取劑，改變提取時間、溫度、液料比等來得到它最佳的提取工藝；二是超聲提取法，利用超聲波的特性來破壞細胞的基質(zhì)，促進番茄紅素的釋放，這種方法的提取效率較高、耗能少、浪費少，是一種較為高效的提取方法；三是微波輻射提取法，這種方法的作用機理與超聲提取法較為類似，利用電磁波的穿透作用來破壞細胞壁，加快番茄紅素的析出，這也是一種高效的新型提取方法。

番茄紅素在各類植物的果實中廣泛存在，但是在各類的研究以及各種參考文獻中，主體的提取材料為番茄、圣女果、西瓜這3 種。在蔡俊等[12]的研究中，用番茄作為提取原料，氯仿作為提取劑，在25 ℃、pH 6.0、90%溶劑用量時提取效果最好。在王海紅等[13]的研究中，用圣女果作為提取原料，丙酮∶石油醚=1 ∶1（體積比）作為提取劑，在 28 ℃、液料比 4 ∶1（mL/g）、提取40 min 時，提取效果最好。在孫利祥等[14]的研究中，用西瓜作為提取原料，含有2%二氯甲烷的正己烷作為提取劑，在 25 ℃、料液比 1 ∶3（g/mL）、pH5.5、提取 2 h時提取效果最好。就目前的研究現(xiàn)狀來說，對番茄紅素提取的原材料方面的研究較少，相對而言番茄紅素提取各方面的數(shù)據(jù)情況還不夠完善。

百香果是西番蓮科西番蓮屬的草質(zhì)藤本植物，人們?nèi)粘Ｉ钪谐Ｒ姷囊环N水果，基本一年四季都可見到它的身影，它具有一定的藥用價值[15]。百香果中的化學成分主要以酚類、黃酮苷類、生物堿等為主，除了抗焦慮、抗疲勞的作用外，還具有抗氧化活性、神經(jīng)保護等作用，常用于失眠、抑郁、神經(jīng)緊張等方面的治療[16-17]。還有研究發(fā)現(xiàn)，百香果皮中的可溶性膳食纖維對乙醇所致大鼠潰瘍具有保護作用[18]。由于對百香果藥用價值的開發(fā)相對較少[19]，本試驗選擇以百香果作為提取材料，一方面可以加強對百香果藥用方面的開發(fā)，提高百香果各方面的利用率和其利用價值，另一方面可以拓寬番茄紅素提取的材料來源，進一步優(yōu)化對番茄紅素的提取。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料

百香果：產(chǎn)自福建龍巖。

1.1.2 主要試劑

蘇丹Ⅰ色素（分析純）、丙酮（分析純）、無水乙醚（分析純）、氯化鈉（分析純）、無水乙醇（分析純）、正己烷（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 儀器

電子分析天平（FA224 型）：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（ZQWY-218N 型）：上海知楚儀器有限公司；高速離心機（Neofuge 15R 型）：上海力申科學儀器有限公司；紫外可見分光光度計（UV-1100）：上海美普達儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 番茄紅素提取

切開百香果，取出果肉于研缽中，研磨粉碎，稱取所需量的果肉并對其進行預(yù)處理，將預(yù)處理后的果肉轉(zhuǎn)入三角瓶中，加入提取劑，封口，置于恒溫振蕩器上，設(shè)置試驗所需要的溫度、時間、轉(zhuǎn)速等進行振蕩提取，用濾紙過濾提取液，置于485 nm 波長的可見分光光度計上測量吸光度。

1.2.2 單因素試驗設(shè)計

1.2.2.1 預(yù)處理設(shè)計

百香果研磨粉碎后，準確稱取10 g 百香果漿液，采用以下方法（表1）對其進行預(yù)處理：每個處理重復(fù)3 次，對于上述有進行離心的預(yù)處理，離心結(jié)束后，倒掉上清液，將果肉挖出，放入三角瓶中。預(yù)處理結(jié)束后，各加入30 mL 丙酮-正己烷2 ∶1（體積比）混合液，放置于35 ℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，以200 r/min 的速度振蕩提取2 h。用濾紙對提取液進行過濾處理后，用丙酮-正己烷2 ∶1（體積比）提取劑調(diào)零，然后在485 nm波長處測量吸光度。

表1 預(yù)處理試驗方案設(shè)計Table 1 Design of pretreatment test scheme

1.2.2.2 最佳提取劑設(shè)計

準確稱取5 g 百香果漿液，對其進行最佳預(yù)處理；取5 組三角瓶，每組3 次重復(fù)，對其進行編號，放入處理好的提取材料；然后在這5 組三角瓶中各自加入15 mL 不同的提取劑：無水乙醚、丙酮、正己烷、丙酮-正己烷 1 ∶1（體積比）、丙酮-正己烷 2 ∶1（體積比）。35 ℃，200 r/min 恒溫振蕩提取2 h，過濾處理后485 nm波長處測量吸光度。

1.2.2.3 最佳提取時間設(shè)計

設(shè)置 5 個不同提取時間：1、1.5、2、2.5、3、3.5 h，并以2 h 為空白對照提取時間。準確稱取5 g 百香果漿液，對其進行最佳預(yù)處理；在6 組三角瓶中加入15 mL丙酮-正己烷2∶1（體積比）混合液。35 ℃，200 r/min 恒溫振蕩提取2 h，過濾處理后485 nm 波長處測量吸光度。

1.2.2.4 最佳液料比設(shè)計

以丙酮-正己烷2 ∶1（體積比）混合液為提取劑，設(shè)置 8 個不同的液料比：1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1、4 ∶1、5 ∶1、6 ∶1、7 ∶1、8 ∶1（mL/g），以 15 mL 提取劑為空白對照添加量。準確稱取5 g 百香果漿液，對其進行最佳預(yù)處理；取9組三角瓶，每組3 次重復(fù)，對其進行編號，放入處理好的提取液。35 ℃，200 r/min 恒溫振蕩提取2 h，過濾處理后485 nm 波長處測量吸光度。

1.2.2.5 最佳提取溫度設(shè)計

設(shè)置 7 個不同的提取溫度：20、25、30、35、40、45、50 ℃，以35 ℃為空白對照提取溫度。準確稱取5 g 百香果漿液，對其進行最佳預(yù)處理；取8 組三角瓶，每組3 次重復(fù)，對其進行編號，在三角瓶中放入處理好的提取液；在8 組三角瓶中加入提取劑，丙酮-正己烷2 ∶1（體積比）15 mL。200 r/min 恒溫振蕩提取2 h，過濾處理后485 nm 波長處測量吸光度。

1.2.3 正交試驗設(shè)計

在單因素試驗條件的基礎(chǔ)上，根據(jù)番茄紅素的提取情況作為參考因素，選取提取時間、提取溫度和液料比這3 個因素，再選取這3 個試驗因素中峰值附近的3 個水平對正交試驗進行設(shè)置，進行正交試驗分析，正交方案設(shè)計如表2 所示。

表2 正交試驗因素及水平Table 2 Factors and level of orthogonal test

1.2.4 番茄紅素標準曲線制作及含量的測定

由于番茄紅素純標準品性質(zhì)極不穩(wěn)定，且它的價格昂貴，而蘇丹Ⅰ色素性質(zhì)穩(wěn)定且價格便宜，它的性質(zhì)與番茄紅素相近，故番茄紅素標準曲線制作采用蘇丹Ⅰ色素代替番茄紅素標準品[20]；標準曲線的制作按照《GB/T 14215-2008 番茄醬罐頭》[21]的要求進行制作，番茄紅素最大吸收波長也采用上述標準的波長485 nm。番茄紅素含量測定計算公式如下：

式中：X 表示試樣中番茄紅素的含量，mg/100 g；C表示試樣色素提取液中番茄紅素的濃度，μg/mL；M 表示試樣質(zhì)量，g。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2007 軟件對試驗的數(shù)據(jù)進行整理和建庫，SPSS 20.0 軟件對正交試驗數(shù)據(jù)進行方差分析和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗分析

2.1.1 預(yù)處理分析

新鮮的百香果中含水量較大，預(yù)處理中用無水乙醇浸泡是對百香果細胞進行脫水處理，使得番茄紅素可以加快溶解于提取劑中；對百香果進行冷凍處理是讓百香果細胞質(zhì)基質(zhì)中的水分凍結(jié)，形成晶體，從而破壞胞基質(zhì)同時使得細胞壁破裂，讓番茄紅素能夠加快析出。加入氯化鈉，使得在細胞內(nèi)外就形成了一個濃度差，從而促進細胞內(nèi)的水分和一些無機鹽以及胞內(nèi)色素的析出，從而提高番茄紅素的提取效果。對百香果進行離心處理，通過高速的離心來破壞細胞結(jié)構(gòu)，使得細胞壁破裂，而番茄紅素不溶于水，離心后處理后，番茄紅素就基本集中于沉淀于底下的果肉中，在上清液的含量相對較少，故之后對其進行提取時倒去上清液，用沉淀于底下的百香果果肉進行提取。不對百香果進行任何處理，可以與其他預(yù)處理形成鮮明對比。不同的預(yù)處理對百香果中番茄紅素提取的影響見圖1。

圖1 不同的預(yù)處理對百香果中番茄紅素提取的影響Fig.1 Effect of different extraction pre-treatments on extraction efficiency lycopene from passion fruit

由圖1 可知，用無水乙醇浸泡30 min，15 000 r/min離心處理與不用無水乙醇浸泡直接拿去離心處理的提取效果，優(yōu)于用冷凍處理和氯化鈉處理的效果，而不做任何處理的提取效果最差。用無水乙醇浸泡30 min，15 000 r/min 離心處理與不用無水乙醇浸泡直接拿去離心處理的效果差異不大，說明無水乙醇對百香果細胞的脫水效果并不顯著；加入氯化鈉的預(yù)處理效果優(yōu)于放置于冰箱冷凍的效果。故綜上所述，最優(yōu)的預(yù)處理為15 000 r/min、離心15 min，接下去各試驗的預(yù)處理均采取離心處理。

2.1.2 最佳提取劑分析

不同提取劑對番茄紅素提取的影響見圖2。

圖2 不同提取劑對番茄紅素提取的影響Fig.2 Effect of different extractant on extraction efficiency

由圖2 可知，番茄紅素在各個提取劑中的析出情況不一，也就造成了提取效果的差異，其中以丙酮-正己烷2 ∶1（體積比）混合提取劑的提取效果最佳，其次分別為丙酮-正己烷1 ∶1（體積比）、丙酮、無水乙醚等，正己烷的提取效果最差。非混合的提取劑提取效果較差，混合提取劑的提取效果較優(yōu)，說明兩種溶劑混合后，相互促進，大大提高了番茄紅素的提取效果。而丙酮和正己烷混合液中，以2 ∶1（體積比）混合的效果優(yōu)于 1 ∶1（體積比）的混合效果。

2.1.3 最佳提取時間分析

不同提取時間對番茄紅素提取量的影響見圖3。

圖3 提取時間對番茄紅素提取量的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction efficiency

如圖3 所示，番茄紅素的提取效果與提取時間呈現(xiàn)一個近似正態(tài)分布的圖像，前期隨時間進行遞增，為正相關(guān)關(guān)系，達到最高峰后隨時間進行遞減，為負相關(guān)關(guān)系，峰值的時間為2.5 h，前期的提取量之所以會隨時間遞增，這是因為番茄紅素是一種胞內(nèi)色素，其主要存在于細胞的有色體中，番茄紅素的析出需要一個緩慢的過程，從細胞中逐漸溶解到有機溶劑中，從而達到一種動態(tài)平衡。提取時間超過2.5 h 后，其提取量下降，這是由于番茄紅素的不穩(wěn)定性造成的，對光、對熱的不穩(wěn)定性，會造成番茄紅素的降解，從而導(dǎo)致提取量減少。番茄紅素對日光、紫外光等較為敏感，過長時間的日光暴曬和紫外光照射都會引起番茄紅素的降解，故提取時間也不宜過長。因此番茄紅素的最適提取時間為2.5 h。

2.1.4 最佳液料比分析

液料比對番茄紅素提取的影響見圖4。

圖4 液料比對番茄紅素提取的影響Fig.4 Effect of liquid to solid ratio on extraction efficiency

如圖4 所示，番茄紅素的提取效果與液料比呈現(xiàn)一個近似半邊正態(tài)分布的圖像，前期隨液料比的遞增進行遞增，為正相關(guān)關(guān)系，達到最高峰后隨液料比的遞增進行遞減，為負相關(guān)關(guān)系，峰值的液料比為3 ∶1（mL/g），后期隨著液料比的增加，吸光度呈現(xiàn)下降趨勢，說明液料比在3 ∶1（mL/g）的時候，提取液中的番茄紅素基本析出，繼續(xù)增加提取劑的量就相當于將番茄紅素濃度稀釋。因此，番茄紅素的最佳液料比為3 ∶1（mL/g）。

2.1.5 最佳提取溫度分析

番茄紅素對熱具有較為良好的穩(wěn)定性，在付晶等[22]的研究中，較低的溫度不會使番茄紅素發(fā)生變性，它的熱損失率較小，但是過高的溫度會使得番茄紅素發(fā)生異構(gòu)化反應(yīng)和氧化降解反應(yīng)[23]，所以溫度過高會對番茄紅素的提取產(chǎn)生不利的影響。

圖5 提取溫度對番茄紅素提取量的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction efficiency

如圖5 所示，番茄紅素的提取效果與提取溫度也呈現(xiàn)一個近似正態(tài)分布的圖像，前期隨提取溫度的遞增進行遞增，為正相關(guān)關(guān)系，達到最高峰后隨提取溫度的遞增進行遞減，為負相關(guān)關(guān)系，峰值的提取溫度為40 ℃，前期番茄紅素的析出效果與提取時間之所以會呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，是因為溫度的升高加快了分子的運動，隨之促進了番茄紅素分子的析出，同時有機溶劑對番茄紅素的溶解能力也增加，其析出量也就變大了；溫度超過40 ℃后它的提取量下降，這是因為較高的溫度會使得番茄紅素產(chǎn)生異構(gòu)化和降解等其他的反應(yīng)，從而造成了番茄紅素提取量的下降；因此，本試驗中番茄紅素提取的最佳提取溫度為40 ℃。

2.2 正交試驗分析

由圖3～圖5 可知，在不同提取時間、提取溫度和液料比處理下，番茄紅素的提取效果均存在差異。故而在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)正交試驗設(shè)計原理，選取提取時間A、提取溫度B 和液料比C 作為3 個因素，試驗方案及結(jié)果見表3 和表4。

表3 正交試驗極差分析Table 3 The range analysis of orthogonal experiment

表4 正交試驗方差分析Table 4 Analysis of orthogonal test difference

表3 為正交試驗極差分析，液料比對提取效果的影響最大，溫度次之，時間最小，不過二者R 的數(shù)值差異不大，故對番茄紅素提取效果影響相差不是很大。從表中可以看出，根據(jù)吸光度的大小從而來判斷番茄紅素的析出效果，其中，吸光度最高的處理是試驗號為7 的處理，其處理條件為A3B1C2，以此認定番茄紅素最佳的提取處理為：提取時間3 h，提取溫度35 ℃，液料比 3 ∶1（mL/g）。

表4 是對正交試驗進行顯著性分析，根據(jù)表格中的F、P 可知，液料比對番茄紅素的提取具有顯著影響，提取時間和提取溫度的F 值相差不大，故二者對提取效果影響相近且不具顯著影響。從以上兩個表格可知，正交試驗的極差分析和顯著性分析結(jié)果相對一致，都是液料比為主要影響因素，提取時間和提取溫度為次要影響因素且影響效果相近。

2.3 驗證試驗

對正交試驗所確定的最佳提取條件進行驗證分析，以單因素試驗的最佳提取條件作為對照，試驗重復(fù)3 次，結(jié)果見表5。

表5 正交試驗驗證Table 5 Verification of orthogonal experiments

從表5 可知，正交試驗的吸光度高于單因素試驗的吸光度，即正交試驗番茄紅素的提取量大于單因素試驗，故正交試驗的提取條件優(yōu)于單因素試驗的提取條件，所以，本試驗中百香果種番茄紅素最佳的提取工藝為：提取時間3 h、提取溫度35 ℃、液料比 3 ∶1（mL/g）。

2.4 標準曲線的建立及含量的計算

根據(jù)GB/T 14215-2008《番茄醬罐頭》中的方法制作標準液，所得數(shù)據(jù)用Excel 2007 進行處理，得出番茄紅素標準曲線，為：y=0.221 5x-0.005 1，R2=0.999 3。曲線如圖6 所示。

圖6 番茄紅素標準曲線圖Fig.6 Standard curve of lycopene

準確稱取5 g 百香果磨碎的果肉，按照最佳提取工藝進行處理，根據(jù)標準曲線及計算公式計算番茄紅素的含量，結(jié)果為百香果中番茄紅素的提取量為3.54 mg/100 g。

3 結(jié)論

試驗結(jié)果表明：將百香果的研磨液放置于15000r/min的高速離心機中離心15 min 為最佳的預(yù)處理方法；用丙酮-正己烷2 ∶1（體積比）混合液作為提取劑時提取對番茄紅素的溶解效果較好，其中液料比為主要影響因素，提取時間和提取溫度為次要影響因素且影響效果相近。本試驗番茄紅素的最佳提取工藝為：提取時間 3 h、提取溫度 35 ℃、液料比 3 ∶1（mL/g）。

本試驗對提取劑的選擇是參照李麗杰等[24]的研究進行設(shè)置的，可能還存在其他提取劑對番茄紅素的溶解效果更好的情況；在提取條件上，再進行更進一步的優(yōu)化時，可以考慮改變提取劑的pH，來得到更優(yōu)化的提取條件，因為在堿性條件下，番茄紅素更容易被破壞掉。

番茄紅素從被發(fā)現(xiàn)至今，也算是經(jīng)歷了一個較為漫長的過程，從最初的不被重視，到越來越多的生理功能被發(fā)覺出來，番茄紅素越發(fā)得到人們的青睞。隨著時代的發(fā)展，人們對生活質(zhì)量的要求越加提高，尤其在食品安全方面更為關(guān)注，在各種不合格的食品添加劑事件層出不窮時，番茄紅素作為一種天然的功能性色素，對人體存在諸多好處，在食品添加劑方面存在著天然的優(yōu)勢。可能隨著對番茄紅素研究的深入，更多的功能會被發(fā)掘出來，大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)方面的工藝可能會日益完善，番茄紅素將可能被應(yīng)用到更加廣闊的領(lǐng)域中。