劉田園，丁惠，陳衍男，趙恒強(qiáng)，王曉，王明林，崔莉，*

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院），山東省分析測試中心，山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250014；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安271018；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南250355）

金銀花又名二花、雙花等[1]，是忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或初開的花，其主要成分包括有機(jī)酸類、黃酮類、環(huán)烯醚萜類、三萜皂苷類、糖類等[2-3]。金銀花藥用歷史悠久，幾千年來用于中醫(yī)治療傳染病以及溫病發(fā)熱、癰腫疔瘡、咽喉腫痛等癥[4-5]，更是傳統(tǒng)的藥食兩用中藥材，廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域[6]。金銀花工業(yè)化提取的核心是煎煮加熱，綠原酸等有機(jī)酸類成分是金銀花清熱解毒功效的重要藥理學(xué)基礎(chǔ)[7]，以金銀花水提液為基礎(chǔ)開發(fā)的功能飲料不僅能夠清熱降火、消暑解渴，還具有一定的利膽保肝、降低血脂、增強(qiáng)免疫力等保健作用[8-9]。

目前金銀花提取的研究以醇提取物為主[10]，水提物及提取過程研究相對較少。段曉穎[11]采用正交試驗(yàn)法以綠原酸為指標(biāo)優(yōu)選出了金銀花的最佳水提工藝；許哲等[12]以綠原酸為指標(biāo)對金銀花的傳統(tǒng)水煎法、乙醇回流法、動態(tài)溫浸法、超聲提取法、乙醇滲漉法等各種工藝進(jìn)行了比較研究；尚麗霞等[13]采用高效液相色譜法研究了不同提取工藝、不同提取時間、不同濃縮干燥方法對綠原酸含量的影響；余杰等[14]考察了加水量、煎煮溫度、煎煮時間對綠原酸提取率的影響；王盈峰等[15]通過正交試驗(yàn)，綜合水浸出物、氨基酸、黃酮和綠原酸含量4 項指標(biāo)得到金銀花的最適浸提條件。相關(guān)研究主要集中在工藝優(yōu)化，而水提工藝中的浸提時間的選擇尚未見系統(tǒng)研究報道，而且目前相關(guān)研究主要以綠原酸為單一質(zhì)量指標(biāo)，金銀花中有機(jī)酸成分主要是綠原酸類化合物，迄今已分離出40 多種，雖然綠原酸是其中主要的成分，但金銀花的內(nèi)在質(zhì)量并不是靠單一成分所決定的，而是多種成分相結(jié)合，并同時起作用才可達(dá)到預(yù)期效果[16]，金銀花浸提水提過程中多種有機(jī)酸成分的變化規(guī)律亟待研究，因此本文采用多指標(biāo)評價的方法研究浸泡時間對金銀花中多種有機(jī)酸類成分水提效果的影響，以期為金銀花加工生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

金銀花：山東宏濟(jì)堂醫(yī)藥有限公司中藥廠；乙腈（色譜純）：美國Tedia 公司；甲酸（色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；純凈水：杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；綠原酸對照品（純度＞98%）：成都德思特生物技術(shù)有限公司；異綠原酸A/B/C 對照品、異綠原酸、隱綠原酸對照品、獐牙菜苷對照品（純度均＞98%）：上海同田生物技術(shù)股份有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（BSA2202S-CW）：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；DFD-700 儀表恒溫水浴鍋：上海樹立儀器儀表有限公司；高效液相色譜儀（S6000）：華譜新創(chuàng)科技有限公司；YMC-Pack ODS-A 色譜柱（250×4.6 mml.D.，S-5 μm，12 nm）：日本 YMC 公司；針筒式濾膜過濾器：天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 浸泡時間對水提效果影響的考察

熱水浸提，以1 ∶30 質(zhì)量比進(jìn)行試驗(yàn)，設(shè)置不同的浸泡時間（0、30、60、90 min），分別采用 80、95 ℃提取，提取總時長為120 min，各3 組平行試驗(yàn)。每間隔15 min取 1 mL 提取液，凍干，甲醇復(fù)溶，過 0.45 μm 濾膜注入液相色譜進(jìn)樣瓶待測。

1.2.2 金銀花水提液中成分分析

采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測水提液中主要有機(jī)酸類成分，色譜條件：流速 0.3 mL/min，進(jìn)樣量 5 μL，檢測波長254 nm，流動相為：A 乙腈（1.0%甲酸），B 水（1.0%甲酸），梯度洗脫：0～5 min，10%～17%A；5 min～30 min，17 %～22 %A；30 min～40 min，22 %～35 %A；40 min～45 min，35%～40%A；45 min～60 min，40%A。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：用無水甲醇準(zhǔn)確配制濃度為1.00 mg/mL 的新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、獐牙菜苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C 標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取200 μL 混合，按上述色譜條件進(jìn)樣 1、5、10、15、20 μL，測定峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。新綠原酸：y=394.92x-40.564，R2=0.999 1；綠原酸：y = 501.99x-311.37，R2=0.999 2；隱綠原酸：y=504.63x-176.01，R2=0.999 4；獐牙菜苷：y=603.29x-284.05，R2=0.999 2；異綠原酸 B：y=618.31x-445.99，R2=0.999 2；異綠原酸 A：y=611.15x-139.42，R2=0.999 1；異綠原酸 C：y=672.35x-342.59，R2=0.999 3。R2均大于0.999，線性良好。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC分析

建立金銀花水提液中7 種成分的HPLC 檢測方法，見圖1。

圖1 金銀花提取液和7 種化合物混標(biāo)的HPLC 圖Fig.1 HPLC diagram of the mixed extract of Lonicera japonica Thunb.water extract and seven compounds

通過HPLC 標(biāo)準(zhǔn)品比對7 種化合物分別為新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、獐牙菜苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C，同時采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）進(jìn)行定性確認(rèn)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

2.2 金銀花水提液中有機(jī)酸類成分的變化規(guī)律

2.2.1 新綠原酸

新綠原酸的提取效果如圖2 所示。

圖2 新綠原酸在不同溫度下提取量變化圖Fig.2 Change of extraction amount of new chlorogenic acid at different temperature

在80 ℃和95 ℃提取時，4 種條件下水提液中新綠原酸含量均呈上升趨勢，且直接提取＞浸泡30 min＞浸泡90 min＞浸泡60 min，直接提取的效果明顯優(yōu)于常溫（20 ℃左右）浸泡，特別是95 ℃提取時，不浸泡直接提取時新綠原酸溶出速度快、提取量大，所得的水提液中的新綠原酸含量最高。80 ℃提取時整個提取時段中90 min～120 min 內(nèi)新綠原酸含量相對穩(wěn)定。與80 ℃條件相比，95 ℃下各組間提取效果差異更明顯，新綠原酸在95 ℃下提取效果比80 ℃效果好，其中95 ℃直接提取得到的新綠原酸含量最高，在浸泡90 min 后提取時，均在105 min 后出現(xiàn)含量下降的趨勢。

2.2.2 綠原酸

綠原酸是金銀花最主要的有機(jī)酸成分，在檢測的7 種有機(jī)酸中含量最高，結(jié)果見圖3。

圖3 綠原酸在不同溫度下提取量變化圖Fig.3 Change of extraction amount of chlorogenic acid at different temperature

80 ℃提取時綠原酸提取量：浸泡30 min＞浸泡60 min＞直接提?。窘?0min，常溫浸泡30 min 時提取60 min 后綠原酸溶出速率降低。95 ℃提取時綠原酸提取量：浸泡30 min＞浸泡60 min＞浸泡90 min＞直接提取，75 min 以后各組提取量均增速變緩。80 ℃和95 ℃下均在浸泡30 min 后提取效果最好好，提取45 min 時的提取量均高于直接浸提105 min 時的提取量，其中浸泡30 min 后95 ℃提取得到的綠原酸含量最高。在浸泡時間達(dá)到90 min 后，均在浸提105 min 后出現(xiàn)綠原酸含量下降?？傮w來看綠原酸在95 ℃下提取效果比80 ℃提取效果稍好。

2.2.3 隱綠原酸

隱綠原酸提取量的變化規(guī)律與新綠原酸相似，但其含量較新綠原酸低，結(jié)果見圖4。

圖4 隱綠原酸在不同溫度下提取量變化圖Fig.4 Change of extraction amount of cryptochlorogenic acid at different temperature

80 ℃和95 ℃提取時隱綠原酸含量均為：直接提取＞浸泡30 min＞浸泡90 min＞浸泡60 min，隨著提取時間的延長，水提液中隱綠原酸的含量總體呈上升趨勢。隱綠原酸在95 ℃下提取效果比80 ℃效果好，直接提取組的隱綠原酸溶出速度快、提取量大，所得的水提液中的隱綠原酸含量最高。與綠原酸類似，在浸泡90 min 后浸提時，在提取105 min 后隱綠原酸含量也出現(xiàn)下降。

2.2.4 獐牙菜苷

獐牙菜苷是一種環(huán)烯醚萜類化合物，具有良好的抗炎效果[17]，其提取效果見圖5。

80 ℃提取時提取量：浸泡90 min＞浸泡60 min＞浸泡30min＞直接提取，其中直接浸提和浸泡30min 后提取效果相近，在45 min 后提取量變化趨緩。95 ℃提取時：浸泡90 min＞浸泡60 min＞直接提?。窘?0min。浸泡60 min、90 min 后，隨提取時間的延長，獐牙菜苷含量在80 ℃提取時比95 ℃時增加更快，且最終提取量更高，浸泡90 min 后95 ℃提取時獐牙菜苷含量持續(xù)較高且相對穩(wěn)定。浸泡90 min 后，兩個溫度下浸提105 min 時獐牙菜苷含量都出現(xiàn)下降。

圖5 獐牙菜苷在不同溫度下提取量變化圖Fig.5 Change of extraction amount of sweroside at different temperature

2.2.5 異綠原酸B

異綠原酸B 在兩個提取溫度下總體變化規(guī)律類似，結(jié)果見圖6。

隨提取時間的延長，均呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，在60 min 前增加迅速，之后含量的增加減緩，趨于平穩(wěn)，浸泡時間對提取量的影響差別較小。95 ℃直接提取時異綠原酸B 含量呈現(xiàn)明顯的先增加后減小的趨勢，與其他3 組差異明顯，在浸泡90 min 的兩個提取溫度下，均在105 min 后出現(xiàn)含量下降現(xiàn)象。

圖6 異綠原酸B 在不同溫度下提取量變化圖Fig.6 Change of extraction amount of isochlorogenic acid B at different temperature

2.2.6 異綠原酸A

異綠原酸A 的提取量總體呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢見圖7。

圖7 異綠原酸A 在不同溫度下提取量變化圖Fig.7 Change of extraction amount of isochlorogenic acid A at different temperature

隨著浸泡時間延長，提取量減少，浸泡60 min 和浸泡90 min 差異不明顯，即直接提?。窘?0 min＞浸泡90 min 和浸泡60 min。80 ℃浸提時，提取45 min～60 min 后異綠原酸A 含量開始下降，95 ℃浸提時，隨提取時間的延長，異綠原酸A 含量的降低速率較80 ℃浸提時更快。80 ℃直接提取，45 min 時提取量最高。

2.2.7 異綠原酸C

浸泡時間對異綠原酸C 提取量的影響差別顯著，結(jié)果見圖8。

圖8 異綠原酸C 在不同溫度下提取量變化圖Fig.8 Change of extraction amount of isochlorogenic acid C at different temperature

直接提?。窘?30 min ＞浸泡 90 min 和浸泡60 min，隨提取時間延長，各組均呈現(xiàn)緩慢穩(wěn)態(tài)上升的趨勢，95 ℃直接提取時含量顯著優(yōu)于其他各條件，異綠原酸C 在水提液中的含量：95 ℃直接提?。窘?0 min，95 ℃提?。?0 ℃直接提?。窘?90 min，95 ℃提取＞浸泡 60 min，95 ℃提取＞浸泡 30 min，80 ℃提?。窘?60 min，80 ℃提取＞浸泡 90 min，80 ℃提取。在浸泡90 min 后提取105 min 時出現(xiàn)含量下降。

2.2.8 7 種有機(jī)酸類成分總提取量

對7 中有機(jī)酸類成分的總提取量進(jìn)行比較，結(jié)果見圖9。

80 ℃時提取量：直接提取＞浸泡30 min＞浸泡60 min＞浸泡 90 min；95 ℃時：直接提取＞浸泡 30 min＞浸泡90 min＞浸泡60 min。綜合比較來看，直接95 ℃提?。窘?0 min 95 ℃提取＞直接80 ℃提?。窘?0 min 80 ℃提?。窘?90 min 95 ℃提?。窘?60 min 95 ℃提?。窘?0 min 80 ℃提?。窘?0 min 80 ℃提取。

圖9 7 種化合物在不同溫度下總提取量變化圖Fig.9 Total extraction amount of 7 compounds at different temperature

2.3 討論

浸泡時間對提取過程中多種有機(jī)酸類成分的影響存在差異，隨著浸泡時間的延長，提取量也存在或增或減的不同情況。加水浸泡能讓藥材原本干燥萎縮呈緊密狀態(tài)的細(xì)胞外壁膨脹變軟，水分進(jìn)入細(xì)胞后，原來以結(jié)晶或其他形態(tài)固定于細(xì)胞內(nèi)的化合物溶解并在藥材內(nèi)部形成較高的滲透壓，壓差使高濃度的內(nèi)容物滲出并溶于水中，加熱提取時，隨著溫度的升高，內(nèi)容物向水中擴(kuò)散的速度加快，藥材內(nèi)部細(xì)胞不斷破裂，水溶液濃度也越來越高，直至藥材與水之間的物質(zhì)交換達(dá)到相對平衡狀態(tài)。李維德[18]在對中藥材加水浸泡提取工藝的研究中發(fā)現(xiàn)浸泡比不浸泡直接加熱提取所得提取物平均得率高出6.89%，經(jīng)充分浸泡后再加熱煎煮提取有效成分效果明顯可提高提取得率，減少煎煮時間，節(jié)省能源消耗，提高經(jīng)濟(jì)效益，但中藥材加水浸泡時間并非越長越好。本研究中新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B 等多種成分均在提取105 min后出現(xiàn)含量下降的趨勢，具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

浸泡過程中觀察到金銀花表面在入水片刻后開始出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)，且靠近水面的金銀花褐變更為嚴(yán)重，推測該現(xiàn)象源自酶促褐變。綠原酸（3-咖啡?？鼘幩幔㈦[綠原酸（4-咖啡?？鼘幩幔⑿戮G原酸（5-咖啡?？鼘幩幔?、異綠原酸 A（3，5-二咖啡?？鼘幩幔惥G原酸 B（3，4-二咖啡?？鼘幩幔?、異綠原酸 C（4，5-二咖啡?？鼘幩幔┚鶠閱慰Х弱？崴岷投Х弱？崴崴M成的綠原酸異構(gòu)體。綠原酸類物質(zhì)其分子結(jié)構(gòu)中有多元酚、不飽和雙鍵及酯鍵3 個不穩(wěn)定部分，前兩者易被氧化，后者易發(fā)生水解[19]。多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是主要參與金銀花酶促褐變的酶類，通過催化酚類物質(zhì)發(fā)生酶促氧化，導(dǎo)致褐變[20]，綠原酸類物質(zhì)其分子結(jié)構(gòu)中有多元酚，可作為PPO 底物，金銀花中PPO 主要存在葉綠體內(nèi)囊體的基質(zhì)上[21]，當(dāng)浸泡過程中藥材內(nèi)部細(xì)胞不斷破裂，酶和底物之間的屏障被打破，發(fā)生氧化反應(yīng)以及一系列的連鎖反應(yīng)[22]。有研究證明采后鮮金銀花的酶促褐變會引起綠原酸和木犀草苷的降解，因此推測干燥金銀花在浸提過程中復(fù)水后酶被激活發(fā)生褐變。

綜上，推測在內(nèi)容物溶出和酶促褐變的雙重作用下，產(chǎn)生了浸泡 0、30、60、90 min 不同條件下各化合物的變化規(guī)律。綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸C 在95 ℃提取效果比80 ℃時好；獐牙菜苷在兩種溫度下提取效果相仿；異綠原酸A 在80 ℃下提取效果比95 ℃時好。水提液中各成分含量從多到少依次為綠原酸＞異綠原酸A＞異綠原酸C＞隱綠原酸＞新綠原酸＞獐牙菜苷＞異綠原酸B，綠原酸在7 種化合物總量中占比最高達(dá)58%。除異綠原酸A 外，各化合物在90 min～120 min 均可得到較為理想的提取效果。由于綠原酸在水提液中含量最高，同時也是金銀花及其產(chǎn)品評價的主要指標(biāo)成分，以綠原酸為主其他化合物為輔綜合結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)效率考量水提液的提取效果。綠原酸的最佳提取條件為浸泡30 min 95 ℃提取，結(jié)合7 種化合物總提取量的變化，提取90 min 時含量較高，因而選擇提取方式為浸泡30 min 95 ℃提取90 min時，綠原酸的提取量和7 種化合物總量均能得到良好的保證。

3 結(jié)論

浸泡對金銀花的提取產(chǎn)生一定的影響，但不是時間越久效果越好，綠原酸在浸泡30 min 后提取效果最好，獐牙菜苷在浸泡90 min 后提取效果最好，隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C 均為：直接提?。窘?0 min＞浸泡90 min 和浸泡60 min，適當(dāng)?shù)慕菽軌蚣涌焯崛∵M(jìn)程，提高得率，降低耗能，綜合考慮7 種有機(jī)酸類成分，浸泡30 min 后95 ℃提取90 min 的提取條件，既能保證較高的活性成分提取量又能保證生產(chǎn)效率。