王杰，王篤軍，李鳳偉，商曰玲，卜雯麗，丁霄霄，余曉紅，*

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.鹽城工學(xué)院海洋與生物工程學(xué)院，江蘇鹽城224051）

海蓬子（Salicornia europaea L.），又名西洋海筍，系藜科（Chenopodiaceae）海蓬子屬（Salicornia）鹽生性植物[1]，種植在海灘鹽堿地、鹽沼地或輕質(zhì)沙地，耐受5%NaCl 濃度的海水，可用海水直接灌溉，不與糧食作物爭(zhēng)土地，爭(zhēng)淡水[2]。海蓬子植株富含礦物質(zhì)元素、膳食纖維、蛋白質(zhì)、維生素和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，不僅可以作為蔬菜直接食用，還可以作為一種草藥，其具有清熱排毒、利尿、減肥、降血脂、活血通絡(luò)和抗壞血病等功效[3]。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）在植物中含量很低，很難從這些天然組織中大量的分離提取[4]。因此，通過生物合成法（植物富集法和微生物發(fā)酵法）獲得GABA 備受學(xué)者關(guān)注[5]。研究表明種子發(fā)芽過程中發(fā)生了大量復(fù)雜的生理生化變化，種子中不斷產(chǎn)生新酶或被激活，一些大分子物質(zhì)如淀粉和蛋白質(zhì)被分解，種子中原來含量低或不具有的功能成分如GABA 等大量富集[6]。發(fā)芽過程中，種子中的L-谷氨酸（L-glutamic acid，L-Glu） 在谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）催化下脫羧形成GABA，而二胺（polyamines，PAs） 經(jīng)二胺氧化酶 （diamine oxidase，DAO）催化形成氨基丁酸，后環(huán)化成吡咯啉，再在吡咯啉脫氫酶（pyrroline dehydrogenase，PDH）作用下形成GABA[7]。有研究表明，大豆正常發(fā)芽5 d 后，發(fā)芽大豆中GABA 含量是原料的4.19 倍[8]。而目前國內(nèi)外對(duì)于海蓬子發(fā)芽富集GABA 的報(bào)道基本沒有。

黃酮類化合物作為一種生理活性物質(zhì)，在許多植物和蔬菜中都有發(fā)現(xiàn)，Lee 等[9]從海蓬子中提取出了異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷兩種黃酮類化合物，發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)能夠抑制糖代謝，利用這一特性研發(fā)出了新的治療糖尿病的藥物。Kong 等[10]進(jìn)行了進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)能大大提升抗氧化酶的生物活性，保護(hù)細(xì)胞的基因，是一種天然抗氧化劑[11]，但以海蓬子種子為材料進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)富集黃酮類化合物的研究鮮有報(bào)道。黃酮類化合物的生成是通過苯丙烷類的合成途徑，研究證實(shí)苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine aminolyase，PAL）、肉桂酸4-羥基化酶（cinnamicacid-4-hydroxylase，C4H），4-香豆酸輔酶 A 連接酶（4-coumarate-CoA ligase，4CL）是苯丙烷類代謝途徑的3 個(gè)關(guān)鍵酶[12-15]。植物種子萌發(fā)后會(huì)發(fā)生一系列的生理代謝變化，主要表現(xiàn)在細(xì)胞生理活性的恢復(fù)和復(fù)雜的生化代謝，從而使籽粒的營養(yǎng)成分發(fā)生重大的變化。周小理等[16]對(duì)苦蕎麥籽粒進(jìn)行發(fā)芽萌發(fā)處理后，發(fā)現(xiàn)萌發(fā)物中黃酮化合物的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于苦蕎麥種子。

本研究通過單因素和正交試驗(yàn)，研究NaCl、赤霉素、pH 值和溫度對(duì)海蓬子發(fā)芽率、黃酮和GABA 的影響，在最優(yōu)的培養(yǎng)條件下，探究關(guān)鍵酶活性對(duì)發(fā)芽過程中GABA 和黃酮類化合物的富集機(jī)制，旨在為開發(fā)功能性海蓬子食品及發(fā)展鹽土農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海蓬子種子：鹽城綠苑鹽土農(nóng)業(yè)科技有限公司；GABA 標(biāo)準(zhǔn)品：青島捷世康生物有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、磷酸吡哆醛（pyridoxal5-phosphatemonohydrate，PLP）、谷氨酸、赤霉素、愈創(chuàng)木酚、過氧化物酶、肉桂酸、苯丙氨酸、β-巰基乙醇：上海生工工程股份有限公司；腐胺、還原型輔酶Ⅱ（reduced coenzyme Ⅱ，NADPH）、對(duì)香豆酸、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、輔酶 A（coenzyme A，CoA）、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）：上海源葉生物科技有限公司；甲醇（色譜純）：上海陸都化學(xué)試劑廠。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV752N 紫外可見分光光度：上海佑科儀器儀表有限公司；FA1104 電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；PB-20 型pH 計(jì)：德國賽多利斯公司；TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HY-4 型調(diào)速多用振蕩器：金壇市城東新瑞儀器廠；Agilent 1290 液相色譜儀：Agilent 公司；150 C 恒溫光照培養(yǎng)箱：常州國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)芽工藝

挑選飽滿均勻的海蓬子種子，用1%的次氯酸鈉消毒15 min 后沖洗至中性，置于鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)盒中，每個(gè)培養(yǎng)盒放置1 000 顆種子，樣品置于恒溫光照培養(yǎng)箱中發(fā)芽，每8 h 噴一次培養(yǎng)液。分別測(cè)定海蓬子發(fā)芽第5 天時(shí)的發(fā)芽率、GABA 含量以及黃酮類化合物的含量。

1.3.2 單因素使驗(yàn)

NaCl 濃度：分別設(shè)置 0、3.5、7.0、10、14 g/L 為 5 個(gè)不同的培養(yǎng)液濃度，每個(gè)梯度設(shè)置3 組平行試驗(yàn)在24 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

赤霉素（gibberellin，GA3）濃度：在 7.0 g/L 的 NaCl培養(yǎng)液中分別加入 0、5、10、20、30 mg/L 的 GA3、每個(gè)梯度設(shè)置3 組平行試驗(yàn)在24℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

pH 值：調(diào)節(jié) 7.0 g/L 的 NaCl 培養(yǎng)液 pH 分別為 5、6、7、8、9，每個(gè) pH 值梯度設(shè)置 3 組平行試驗(yàn)在 24 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

溫度：將7.0 g/L 的NaCl 培養(yǎng)液培養(yǎng)的種子分別放在 18、20、22、24、26 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選擇NaCl 濃度、GA3濃度、pH 值、溫度為考察因素。以發(fā)芽率、GABA 含量、黃酮類化合物含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)無交互作用的正交試驗(yàn)表L9（34），研究各因素及其水平對(duì)發(fā)芽率、GABA 含量、黃酮類化合物含量的影響，正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.4 最優(yōu)條件下關(guān)鍵酶活力測(cè)定

通過正交試驗(yàn)得到最優(yōu)培養(yǎng)液組合，在此條件下，對(duì)發(fā)芽 7 d 內(nèi)的 GAD、DAO 和 PAL、C4H、4CL 活力進(jìn)行測(cè)定。

1.4 測(cè)定指標(biāo)和方法

發(fā)芽率：按照GB/T 3543.4-1995《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程發(fā)芽試驗(yàn)》測(cè)定；黃酮含量測(cè)定：亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法；GABA 含量測(cè)定[17]：稱取0.2 g 發(fā)芽海蓬子干粉溶于5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8 %的三氯乙酸溶液，在40 ℃水浴振蕩 2 h，離心分離，上清液經(jīng) 0.45 μm 濾膜過濾后用于測(cè)定GABA 含量。GABA 測(cè)定采用柱前鄰苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）衍生化反相高效液色譜法來檢測(cè)GABA。高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC） 條件：檢測(cè)器波長為338 nm，色譜柱為 C18ODS 反相柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），色譜柱溫度 25℃；流動(dòng)相比例為 0.1 mol/L 磷酸緩沖液（pH 值為6.0）52 %，甲醇46 %，四氫呋喃2 %，使用前經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，超聲波脫氣后使用，流動(dòng)相流速為1 mL/min；GAD 酶活力測(cè)定：參考Xu 等[18]的方法；DAO 酶活力測(cè)定：參考 Xing 等[19]的方法；PAL 酶活力測(cè)定：參考陳雷等[20]的方法；C4H 酶活力測(cè)定：參考 Lamb 等[21]的方法；4CL 酶活力測(cè)定：參考Koopmann 等[22]的方法。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每組試驗(yàn)設(shè)3 次重復(fù)，取平均值；采用IBM SPASS Statistics 19.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 NaCl 濃度對(duì)發(fā)芽率的影響

NaCl 濃度對(duì)種子發(fā)芽率的影響見圖1。

圖1 NaCl 濃度對(duì)種子發(fā)芽率的影響Fig.1 Effect of NaCl concentrationon on the seed germination rate

由圖1 可知，當(dāng) NaCl 濃度在 0 g/L～20 g/L 時(shí)，海蓬子種子的發(fā)芽率逐漸上升，對(duì)于一定濃度的NaCl，促進(jìn)了種子發(fā)芽，這是因?yàn)楹Ｅ钭訉儆邴}堿地植物，有一定的耐鹽性，低濃度的鹽刺激了種子的生長。當(dāng)NaCl 濃度在7 g/L 時(shí)，種子的發(fā)芽率達(dá)到最大，當(dāng)NaCl濃度大于7 g/L 時(shí)，種子的發(fā)芽率逐漸降低，這是因?yàn)楦邼舛鹊柠}抑制了種子的活性，使種子處于休眠狀態(tài)[23]。因此，NaCl 濃度選擇在 7 g/L～10 g/L 為宜。

2.1.2 GA3濃度對(duì)發(fā)芽率的影響

GA3濃度對(duì)種子發(fā)芽率的影響見圖2。

圖2 GA3 濃度對(duì)種子發(fā)芽率的影響Fig.2 Effect of GA3 concentrationon on the seed germination rate

由圖2 可知，當(dāng) GA3濃度在 0 mg/L～10 mg/L 時(shí)，海蓬子種子發(fā)芽率緩慢升高，在10 mg/L 達(dá)到最大值50 %，隨著GA3濃度的逐漸增大，發(fā)芽率呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)，這是由于GA3作為一種高效植物生長調(diào)節(jié)劑，它能迅速打破種子、塊莖和鱗莖等器官的休眠狀態(tài)，促進(jìn)發(fā)芽生長、發(fā)芽、開花、結(jié)果，但是高濃度的GA3反而會(huì)抑制種子發(fā)芽[24]。因此，GA3濃度控制在10 mg/L 最佳。

2.1.3 pH 值對(duì)發(fā)芽率的影響

pH 值對(duì)種子發(fā)芽率的影響見圖3。

圖3 pH 值對(duì)種子發(fā)芽率的影響Fig.3 Effect of pH on the seed germination rate

由圖3 可知，隨著pH 值的升高，海蓬子種子的發(fā)芽率呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，較低或較高的pH 值都會(huì)對(duì)種子發(fā)芽起到抑制作用，當(dāng)pH 值為8 時(shí)，種子發(fā)芽率最高，為50%，因?yàn)楹Ｅ钭訉儆谀望}堿性植物，弱堿性條件下，對(duì)其生長發(fā)育起到一定的促進(jìn)作用。因此，種子發(fā)芽pH 值以8.0 為宜。

2.1.4 溫度對(duì)發(fā)芽率的影響

溫度對(duì)種子發(fā)芽率的影響見圖4。

圖4 溫度對(duì)種子發(fā)芽率的影響Fig.4 Effect of temperature on the seed germination rate

由圖4 可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度為18 ℃～22 ℃時(shí)，種子的發(fā)芽率逐漸升高，溫度為22 ℃時(shí)發(fā)芽率達(dá)到最大值為50%。但是隨著溫度的升高，發(fā)芽率逐漸降低，這是因?yàn)檩^高的溫度導(dǎo)致酶活性降低，一定程度上抑制了種子的萌芽[25]。故發(fā)芽溫度為22 ℃～24 ℃為宜。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選擇NaCl 濃度、GA3濃度、pH 值、溫度為考察因素，以發(fā)芽率、GABA 含量、黃酮類化合物含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

正交試驗(yàn)發(fā)芽率直觀分析見表3。

表3 正交試驗(yàn)發(fā)芽率直觀分析Table 3 Germination rate intuitive analysis of orthogonal test

由表3 可知，RB>RA>RD>RC，表明 pH 值對(duì)發(fā)芽率的影響最大，NaCl 濃度次之，其他依次是溫度，GA3濃度。

正交試驗(yàn)發(fā)芽率方差分析見表4。

表4 正交試驗(yàn)發(fā)芽率方差分析Table 4 Germination rate variance analysis of orthogonal test

由表4 可知，影響種子發(fā)芽的各因素顯著次序?yàn)閜H 值＞NaCl 濃度＞溫度＞GA3濃度，其中 NaCl 濃度和pH 值均有顯著性影響。

正交試驗(yàn)黃酮類化合物直觀分析見表5。

表5 正交試驗(yàn)黃酮類化合物直觀分析Table 5 Flavonoids intuitive analysis of orthogonal test

由表5 可知 RB＞RA＞RC＞RD，表明 pH 值對(duì)黃酮類物質(zhì)富集含量影響最大，NaCl 濃度次之，其他依次是GA3濃度，溫度。

正交試驗(yàn)黃酮化合物方差分析見表6。

表6 正交試驗(yàn)黃酮化合物方差分析Table 6 Flavonoids variance analysis of orthogonal test

由表6 可知，影響種子發(fā)芽的各因素顯著次序?yàn)閜H 值＞NaCl 濃度＞GA3濃度＞溫度，其中 NaCl 濃度和pH 值均有顯著性影響。

正交試驗(yàn)GABA 直觀分析可知見表7。

由表7 可知，RA＞RB＞RD＞RC，表明 NaCl 濃度對(duì)黃酮富集含量的影響最大，pH 值次之，其他依次是溫度、GA3濃度。

表7 正交試驗(yàn)GABA 直觀分析Table 7 GABA intuitive analysis of orthogonal test

正交試驗(yàn)GABA 方差分析見表8。

表8 正交試驗(yàn)GABA 方差分析Table 8 GABA variance analysis of orthogonal test

由表8 可知，影響種子發(fā)芽的各因素顯著次序?yàn)镹aCl 濃度＞ pH 值＞溫度＞GA3濃度，其中 pH 值和 NaCl濃度均有顯著性影響。

通過正交試驗(yàn)獲得海蓬子種子發(fā)芽的最優(yōu)培養(yǎng)液組合為 A2B3C1D3，即 NaCl 濃度為 7 g/L，pH 值為 8，GA3濃度為5 mg/L，溫度24 ℃。但在正交設(shè)計(jì)表中并沒有該組合的試驗(yàn)，按此組合補(bǔ)充驗(yàn)證試驗(yàn)，如表9。

表9 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 9 Results of verification experiments

在此條件下，海蓬子在第5 天時(shí)種子發(fā)芽率為59.28%，黃酮類化合物含量為31.601 μg/mL.，GABA含量為311.34 mg/100 g，高于正交試驗(yàn)組合，因此此條件為最佳。

2.3 最優(yōu)條件下關(guān)鍵酶活性變化

發(fā)芽過程中GAD、DAO 活性的變化及GABA 含量的變化見圖5、圖6、圖7。

圖5 發(fā)芽過程中GAD 活性的變化Fig.5 Changes of GAD enzyme activity during germination

圖6 發(fā)芽過程中DAO 活性的變化Fig.6 Changes of DAO enzyme activity during germination

圖7 發(fā)芽過程中GABA 含量的變化Fig.7 Changes of GABA content enzyme activity during germination

由圖5、圖6 和圖7 可知，最優(yōu)條件下發(fā)芽的海蓬子GAD 和DAO 活性較對(duì)照顯著提高，培養(yǎng)4 d 時(shí)，GAD 和DAO 活性較對(duì)照提高了3.10 倍和2.97 倍，結(jié)合表3，GABA 的變化趨勢(shì)與 GAD 和 DAO 相似，GABA 在第5 天含量達(dá)到最大值，而GAD 和DAO 活性在第4 天達(dá)到最大，這可能是因?yàn)榉N子中的谷氨酸在GAD 和DAO 酶的催化作用下生成GABA 有一定的作用時(shí)間。本研究結(jié)果與前期文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。白青云等[26]研究表明鹽脅迫條件可以使粟谷中GAD 活性增加，植物體內(nèi)游離態(tài)多胺（polyamines，PAs）含量升高，PAO、DAO 活性也隨之升高GABA 得以富集。蘇國興等用NaCl 處理大豆幼苗，發(fā)現(xiàn)大豆根系GABA 含量隨著GAD 活性的提高而提高[27]。

發(fā)芽過程中PAL、C4H、4CL 活性的變化及黃酮類化合物含量的變化見圖8、圖9、圖10、圖11。

圖8 發(fā)芽過程中PAL 活性的變化Fig.8 Changes of PAL enzyme activity during germination

圖9 發(fā)芽過程中C4H 活性的變化Fig.9 Changes of C4H enzyme activity during germination

圖10 發(fā)芽過程中4CL 活性的變化Fig.10 Changes of 4CL activity during germination

圖11 發(fā)芽過程中黃酮類化合物含量的變化Fig.11 Changes of flavonoids content during germination

由圖8、圖9、圖10 和圖11 可知，最優(yōu)條件下發(fā)芽的海蓬子PAL、C4H 和4CL 活性較對(duì)照顯著提高，培養(yǎng) 5 d 時(shí)，PAL、C4H 和 4CL 活性較對(duì)照提高了 1.92倍、1.48 倍和1.52 倍，結(jié)合表2，黃酮的變化趨勢(shì)與PAL、C4H 和4CL 酶活性變化一致，在第5 天含量達(dá)到最大值。PAL、C4H 和4CL 是苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶，可有效調(diào)節(jié)與之相應(yīng)的黃酮類化合物等次生代謝產(chǎn)物的合成，而黃酮類化合物是種子發(fā)芽過程中對(duì)外界環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果[28]。這與周小理等研究苦蕎麥發(fā)芽結(jié)果一致，苦蕎麥進(jìn)行萌發(fā)處理可激活PAL 活性，使得苯丙烷類代謝途徑增強(qiáng)，進(jìn)而黃酮類物質(zhì)的合成也增加[29]。Suzuki 等[30]研究發(fā)現(xiàn)，PAL 活性不僅受植物內(nèi)源物質(zhì)的調(diào)控，光照、溫度、病原菌和植物激素等外源條件同樣能影響其活性，刺激次級(jí)代謝產(chǎn)物黃酮的生成。

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗(yàn)探討了NaCl 濃度、GA3濃度、pH 值、溫度對(duì)海蓬子發(fā)芽率的影響，經(jīng)正交試驗(yàn)，以發(fā)芽率，黃酮、GABA 含量變化為指標(biāo)確定了海蓬子最佳的培養(yǎng)條件為NaCl 濃度為7 g/L，pH 值為8，GA3濃度為5 mg/L，溫度24 ℃，在此條件下，海蓬子種子發(fā)芽率為59.28%，黃酮富集含量為31.601 μg/mL，比發(fā)芽初期增加了2 倍，GABA 富集含量為311.34 mg/100 g，比發(fā)芽初期增加了3.5 倍。對(duì)比最優(yōu)條件和純水培養(yǎng)條件的關(guān)鍵酶活性，GAD 和DAO 酶活力呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，在第4 天達(dá)到最大值，較對(duì)照提高了3.10 倍和2.97 倍，對(duì)GABA 積累有協(xié)同作用；PAL，C4H，4CL 酶活力呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，在第5 天達(dá)到最大值，較對(duì)照提高了1.92 倍、1.48 倍和1.52 倍，與黃酮類化合物含量變化趨勢(shì)一致。海蓬子在鹽堿性條件發(fā)芽過程中，GABA 和黃酮類物質(zhì)均有所增加，但是對(duì)于如GaCl2、ABA 等其他鹽脅迫條件有待進(jìn)一步的深入研究。本研究為海蓬子發(fā)芽富集活性物質(zhì)機(jī)理提供理論依據(jù)以及對(duì)開發(fā)發(fā)芽海蓬子產(chǎn)品具有重要意義。