黃千峰 武 麗 歐燕蘭 艾 君 張 秀

廣東省婦幼保健院(廣州 511400)

卵巢癌(ovarian cancer，OC)是婦科癌癥相關(guān)死亡的最常見原因，我國卵巢癌患者的死亡率在2000年—2003年、2003年—2011年分別上升了21.6%和1.7%，在所統(tǒng)計的多種腫瘤中居首位[1]，我國的癌癥調(diào)查結(jié)果顯示，OC起病隱匿，約75%的病例診斷時已為晚期(FIGO Ⅲ～Ⅳ期),患者預(yù)后差[2]，世界范圍內(nèi)每年23萬例女性診斷為OC，15萬例女性死于OC[3]。 OC的病死率高，以細(xì)胞減滅手術(shù)和以鉑類與紫杉醇為基礎(chǔ)的化療為主要治療方法，但晚期OC患者的5年生存率僅5%～30%。OC的治療通常是以鉑類藥物、紫杉醇為基礎(chǔ)化療，患者對該類化療反應(yīng)良好，但藥物的特異度不高，耐藥性已成為治療OC的關(guān)鍵障礙[4]，化療耐藥成為困擾婦科醫(yī)生的難題，因此，發(fā)掘新的抗腫瘤藥物具有重要的臨床意義。

細(xì)胞毒素(cytotoxin, CTX)是眼鏡蛇毒的主要毒性成分之一，是從眼鏡蛇毒中分離出的毒性蛋白，約占粗毒總蛋白40%左右，又稱心臟毒素[5]。是由60～ 63個氨基酸組成的單鏈多肽, 分子量約為6 700 Da,CTX對多種細(xì)胞均具有細(xì)胞毒性，對許多腫瘤細(xì)胞具有選擇性抑制增殖作用，在抗腫瘤研究中引起了廣泛重視，國內(nèi)外眾多研究表明其可阻斷乳腺癌細(xì)胞MDA-MB- 231的遷移與侵襲[6]，對早幼粒白血病細(xì)胞HL60和肺腺癌細(xì)胞A549等多種腫瘤細(xì)胞有選擇性殺傷作用[5,7]，開展CTX- 1抗腫瘤研究前景十分廣闊。目前有關(guān)其抑制卵巢癌細(xì)胞增殖的作用的研究較少。為此，本研究觀察CTX- 1對人卵巢癌SKOV- 3細(xì)胞活性的影響，為其抗卵巢癌提供新的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人卵巢癌SKOV- 3細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Invitrogen Gibco公司)、青霉素-鏈霉素雙抗溶液(美國GIBCO公司)；TRIzol Reagent(Ambion)；Hoechst33258染色試劑盒(南京凱基科技有限公司)；Annexin V -FITC/PI凋亡檢測試劑盒(Invitrogen公司)；胰蛋白酶(0.25% Trypsin、0.25% Trypsin-EDTA)(Gibco 加拿大)；CTX- 1(廣州醫(yī)科大學(xué)實驗室提供)。

1.2 方法

1.2.1 人卵巢癌SKOV- 3細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)SKOV- 3細(xì)胞株。將SKOV- 3細(xì)胞置于濕度95%的恒溫培養(yǎng)箱(5% CO2、37 ℃)中，2 d傳代1次，傳代比例為1:2，維持細(xì)胞處于對數(shù)生長期。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化情況。

1.2.2 MTS法檢測CTX1對人卵巢癌SKOV- 3細(xì)胞活力的影響 取處于對數(shù)生長期的人卵巢癌SKOV- 3細(xì)胞，0.25%胰酶消化重懸，加入96孔培養(yǎng)板中，于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，實驗設(shè)不同濃度的CTX1作用組(4、8、12 μg/mL)[7]和實驗對照組(僅為細(xì)胞懸液，不加入CTX- 1)，用相應(yīng)濃度藥物培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6、12、24 h觀察不同濃度CTX- 1對卵巢癌細(xì)胞 SKOV- 3存活率的影響。每孔分別加入20 μL MTS檢測液，培養(yǎng)4 h，每孔加入 CCK8 溶液10 μL，培養(yǎng)3 h，酶標(biāo)儀490 nm處測定吸光度(A)值，計算細(xì)胞相對活力，細(xì)胞活力 (%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(0加藥)-A(空白)]×100 %。

1.2.3 Hoechst- 33258熒光染色觀察SKOV- 3細(xì)胞核形態(tài)變化 取對數(shù)生長期的SKOV- 3細(xì)胞，消化細(xì)胞按2×105個/孔，將其種植于6孔板爬片，培養(yǎng)6～8 h貼壁，加入濃度為8 μg/mL CTX- 1培養(yǎng)基2 mL，對照組只加等體積完全培養(yǎng)基，分別24 h、48 h后吸盡液體，加入固定液，固定10 min后加入Hoechst- 33258染色。調(diào)整熒光顯微鏡的激發(fā)波長到350 nm，發(fā)射波長到460 nm，上機(jī)觀察細(xì)胞核的形態(tài)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測Annexin V-FITC/PI雙染后SKOV- 3細(xì)胞凋亡情況 消化計數(shù)細(xì)胞，按 6×105/皿的細(xì)胞數(shù)接種在培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞完全貼壁，加入8 μg/mL濃度CTX- 1 2 mL，對照組只加入等體積完全培養(yǎng)基，6、12 h去掉培養(yǎng)基，消化后離心收集細(xì)胞，重懸細(xì)胞于100 μL的1×Annexin-binding buffer溶液中，加入5 μL Annexin V-FITC染液和1 μL 100 μg/mL PI工作液，搖勻室溫下反應(yīng)15 min,再加400 μL 1×Annexin-binding buffer溶液，陰性對照孔只加500 μL 1×Annexin-binding buffer，上機(jī)檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 MTS法檢測CTX- 1對人卵巢癌SKOV- 3細(xì)胞活力的影響

MTS法檢測顯示，伴隨處理藥物濃度的增加、處理時間的延長，SKOV- 3細(xì)胞的活力逐漸下降 (圖1)。表明CTX- 1可抑制SKOV- 3細(xì)胞活力，抑制其在體外的增殖能力，與對照組相比，差異有統(tǒng)計意義(P<0.01)。

圖1 不同濃度CTX- 1處理不同時間后SKOV- 3細(xì)胞活力抑制率與對照組比較， *P<0.01

2.2 Hoechst- 33258熒光染色觀察8 μg/mL CTX- 1處理后SKOV- 3細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化

CTX- 1 8 μg/mL作用于人卵巢癌SKOV- 3細(xì)胞24 h、48 h，鏡下對照組細(xì)胞核完整，著色均勻，熒光黯淡；CTX- 1處理后24 h、48 h，染色質(zhì)凝聚，細(xì)胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，著色不規(guī)則，呈現(xiàn)細(xì)胞凋亡核碎裂典型變化，而且隨時間增加而更趨明顯(圖2)。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測8 μg/mL CTX- 1處理SKOV- 3細(xì)胞Annexin V-FITC/PI雙染后凋亡情況

用8 μg/mL CTX- 1處理后SKOV- 3細(xì)胞6 h、12 h后上機(jī)檢測，發(fā)現(xiàn)晚期凋亡和壞死(右上象限)細(xì)胞較為明顯，而早期凋亡(右下象限)不明顯。對照組凋亡率(3.24±0.47)%；8 μg/mL CTX- 1處理細(xì)胞 6 h、12 h 后，6 h細(xì)胞壞死率為(1.90±0.27)%，晚期凋亡率為(10.96±1.56)%、而早期凋亡率為(1.52±0.39)%，與對照組凋亡率相比P=0.001 1、F=15.16，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；12 h細(xì)胞壞死率為(10.62±0.96)%，晚期凋亡率為(15.07±1.23)%、而早期凋亡率為(1.88±0.17)%，與對照組凋亡率相比P=0.000 1、F=8.873，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；說明CTX- 1能誘導(dǎo)人卵巢癌SKOV- 3細(xì)胞發(fā)生凋亡，并呈時間依賴效應(yīng)，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖 3)。

圖2 用8 μg/mL CTX- 1處理后SKOV- 3細(xì)胞(×400)

3 討 論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，對婦女生命造成嚴(yán)重的威脅，且其發(fā)病率和死亡率有逐年升高的趨勢，死亡率占婦科惡性腫瘤首位[8]。由于大部分患者確診時就已是進(jìn)展型卵巢癌，預(yù)后較差，死亡率高，對人類的生命健康造成了極大的威脅[9]，卵巢癌早期癥狀比較隱匿、進(jìn)展迅速，為婦科的三大惡性腫瘤之一，OC患者的死亡率在2000年—2003年、2003年—2011 年分別上升了21.6%和1.7%，在所統(tǒng)計的多種惡性腫瘤中居首位[1]，患者5年存活率為46%。目前治療仍是手術(shù)輔以鉑類藥物為基礎(chǔ)的化療，該法對早期患者效果顯著，但較多晚期患者易復(fù)發(fā)和產(chǎn)生耐藥，導(dǎo)致預(yù)后不佳[2]，化、放療加手術(shù)是臨床治療OC的常規(guī)主要手段，但隨著藥物的使用，耐藥問題和藥物毒副作用越來越明顯，耐藥成為OC復(fù)發(fā)和治療失敗的主要原因[10]，天然化合物在惡性腫瘤的治療上具有獨(dú)特的優(yōu)勢，越來越受到醫(yī)學(xué)界的關(guān)注與認(rèn)可。

圖3 用 8 μg/mL CTX- 1處理SKOV- 3細(xì)胞后流式儀檢測細(xì)胞凋亡率注：A SKOV- 3細(xì)胞的凋亡率；B 不同時間凋亡率的統(tǒng)計結(jié)果，與對照組比較， * P<0.01

CTX是眼鏡蛇毒中有溶細(xì)胞作用的活性多肽，耐熱性好、生物活性多樣，研究發(fā)現(xiàn)其對黑色素瘤、白血病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、胃癌、軟骨肉瘤和鼻咽癌等具有溶細(xì)胞毒性[11]。CTX- 1能誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞MCF- 7、人白血病細(xì)胞K562、肝癌細(xì)胞H22、白血病細(xì)胞P388凋亡[12]。且CTX抑制腫瘤細(xì)胞增殖有一定選擇性，其抑制腫瘤細(xì)胞增殖效果明顯高于對正常細(xì)胞的抑制，如其對惡性T淋巴細(xì)胞的IC50 明顯小于正常T淋巴細(xì)胞[13]。還可抑制人口腔上皮癌細(xì)胞增殖遷移，誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞凋亡[14]。為了研究CTX- 1抗卵巢癌的作用，發(fā)掘其作為新的抗卵巢癌藥物的潛在價值，我們以人卵巢癌SKOV- 3細(xì)胞作為研究對象，發(fā)現(xiàn)用4～12 μg/mL濃度CTX- 1處理SKOV- 3細(xì)胞，可顯著降低細(xì)胞活性、抑制其增殖。形態(tài)上可以觀察到細(xì)胞核染色質(zhì)呈固縮碎裂、形態(tài)不均一、染色不均勻等凋亡細(xì)胞核形態(tài)，隨著藥物作用時間延長凋亡率增加，8 μg/mL CTX- 1處理細(xì)胞6 h細(xì)胞壞死率為(1.90±0.27)%，晚期凋亡率為(10.96±1.56)%，而早期凋亡率為(1.52±0.39)%；12 h細(xì)胞壞死率為(10.62±0.96)%，晚期凋亡率為(15.07±1.23)%，而早期凋亡率為(1.88±0.17)%，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明其對SKOV- 3細(xì)胞的抑制作用，主要引起細(xì)胞晚期凋亡和壞死。該實驗結(jié)果與吳敏燕等人發(fā)現(xiàn)CTX- 1主要引起細(xì)胞晚期凋亡和壞死,發(fā)揮其抗腫瘤作用結(jié)果一致[7]。

綜上所述，CTX- 1可以降低SKOV- 3細(xì)胞活力，抑制其在體外的增殖能力，誘導(dǎo)其發(fā)生晚期凋亡和壞死。我們在體外細(xì)胞實驗初步探討了CTX- 1抗卵巢癌的作用，為其成為新型抗卵巢癌臨床藥物提供了一定的研究基礎(chǔ)，具體機(jī)制的研究尚在進(jìn)行中。