朱婷婷 何淑明

1 南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院(廣州 510515)

2 南方醫(yī)科大學(xué)附屬小欖醫(yī)院(中山 528415)

葉酸在體內(nèi)參與多種生物過程，其介導(dǎo)的一碳代謝與腫瘤密切相關(guān)[1]。在對(duì)葉酸受體(folic acid receptor，F(xiàn)Rα)與子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer，EC)相關(guān)性的前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)了FRα在EC中過表達(dá)，提示葉酸參與了EC的進(jìn)展過程[2]。 目前學(xué)者們對(duì)葉酸與EC的相關(guān)性研究結(jié)果各異，葉酸對(duì)EC的作用機(jī)制及作用靶點(diǎn)目前尚不明確[3- 5]。本研究擬采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、qPCR和western blot等技術(shù)，探究葉酸對(duì)EC的作用靶點(diǎn)，為了解及闡明葉酸對(duì)EC的作用機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

提取樣品總RNA后，用帶有Oligo的磁珠富集真核生物mRNA。加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物(random hexamers)合成第一條cDNA鏈，加入緩沖液、dNRTPs、RNaseH和DNA polymeraseI合成第二條cDNA鏈，在經(jīng)過QiaQuick PCR試劑盒純化并加緩沖液洗脫之后做末端修復(fù)并連接測(cè)序接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇。最后進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，使用建好的測(cè)序文庫進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序產(chǎn)生的數(shù)據(jù)mapping到參考基因上，獲得基因組上各個(gè)基因的表達(dá)信息。對(duì)比后利用edgeR軟件分析基因在樣本中的差異表達(dá)，計(jì)算出差異基因的Pvalue和FDR。

1.2 qPCR

引物設(shè)計(jì)β-actin(F：5′-TGGCACCAGCACAATGAA-3′， R：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAG-AAGCA-3′)，TRIB3(F：5′-GCCTTTTTCACTCG-GACCCA-3′，R：5′-GCTT-CTTCCTCTCACGGTCA-3′)，INHBE(F：5′-TCTA GTGGCTTGAGGGGTGA-3′，R：5′-GTGTCCTGCTGTGTCCAAGA-3′)，NRBP2-F2(F：5′-TCAATACCACCATTGCTG-CAC-3′,R：5′-TCAGAGTAGGAGCCTGCATT-3′)(廣州輝園苑醫(yī)藥科技有限公司)。用高純總RNA快速提取試劑盒(BIOTEKE)提取總RNA。RT-PCR(嚴(yán)格按使用說明書進(jìn)行)。依次在PCR反應(yīng)管中加入以下反應(yīng)體系：ddH2O、SYBR、cDNA、引物，于熒光qPCR儀(博日)上進(jìn)行qPCR反應(yīng)。以DL 2000DNA marker(TAKARA)標(biāo)記，進(jìn)行跑膠驗(yàn)證。

1.3 Western blot

配置裂解混合液(碧云天)提取細(xì)胞蛋白，用BAC蛋白定量試劑盒(pierce)測(cè)定含量。加入蛋白上樣緩沖液(谷歌生物)進(jìn)行蛋白上樣。加入制備好的SDS-PAGE膠(BIOSHARP sigma)進(jìn)行蛋白樣本電泳。在電轉(zhuǎn)槽中電轉(zhuǎn)(250mA，100min)。封閉液封閉PVDF膜，加入一抗工作液及二抗工作液進(jìn)行免疫反應(yīng),用ECL試劑顯影。以GAPDH antibody(proteintech)為內(nèi)參檢測(cè)NRBP2蛋白表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件分析，兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。生存分析使用Kaplan-meier法和Log Rank檢驗(yàn)，P<0.05表示與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中找到36個(gè)差異基因

上調(diào)基因篩選條件：Log21.3≥0.378 585 112，篩選出18個(gè)上調(diào)基因(見表1)，下調(diào)基因篩選條件Log20.5≤0.514 57，篩選出18個(gè)下調(diào)基因(見表2)。

表1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選的上調(diào)基因

表2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選的下調(diào)基因

2.2 FMN1，TRIB3,INHBE和NRBP2對(duì)子宮內(nèi)膜癌具有生存意義

通過Kplan-Meier分析及l(fā)ong rank檢驗(yàn)，篩選出對(duì)子宮內(nèi)膜癌具有生存意義的基因FMN1，TRIB3,INHBE和NRBP2。生存曲線提示FMN1高表達(dá)的子宮內(nèi)膜癌患者生存率高于低表達(dá)患者(P=0.021)(見圖A)。TRIB3高表達(dá)的子宮內(nèi)膜癌患者生存率低于低表達(dá)患者(P=0.020)(見圖B)。INHBE高表達(dá)的子宮內(nèi)膜癌患者生存率低于低表達(dá)患者(P=0.015)(見圖C)。NRBP2高表達(dá)患者生存率低于低表達(dá)患者(P=0.003 8)(見圖D)。

圖1 FMN1(A)、TRIB3(B)、INHBE(C)、NRBP2(D)基因的生存曲線

2.3 葉酸作用下子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的INHBE和NRBP2mRNA的表達(dá)下調(diào)

通過qPCR檢測(cè)葉酸作用下TRIB3,INHBE和NRBP2 mRNA在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的表達(dá)(見圖2)。對(duì)照組(JEC)與實(shí)驗(yàn)組(JEC+葉酸)中TRIB3mRNA表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.870)(見表3)。與對(duì)照組(JEC)相比，實(shí)驗(yàn)組(JEC+葉酸)中INHBE的mRNA表達(dá)量下降(P=0.020)(見表3)。與對(duì)照組(JEC)相比，實(shí)驗(yàn)組(JEC+葉酸)細(xì)胞中NRBP2的mRNA表達(dá)量明顯下降(P=0.009)(見表3)。

2.4 葉酸作用下子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的NRBP2蛋白表達(dá)下調(diào)

以GAPDH為內(nèi)參，研究通過western blot檢測(cè)葉酸作用下NRBP2基因在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)(見圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組(JEC)相比，實(shí)驗(yàn)組(JEC+葉酸)中NRBP2的蛋白表達(dá)下調(diào)(見表4)。

圖2 為qPCR產(chǎn)物電泳圖1.DL2000；2.JEC，β-actin；3.JEC+葉酸，βactin；4.JEC，TRIB3；5.JEC+葉酸，TRIB3；6.JEC，INHBE；7.JEC+葉酸，INHBE；8.JEC，NRBP2；9.JEC+葉酸，NRBP2

表3 TRIB3,INHBE和NRBP2 mRNA表達(dá)統(tǒng)計(jì)表

續(xù)表

圖3 NRBP2蛋白電泳圖

表4 IOD值測(cè)定

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)最常見惡性腫瘤，發(fā)病率不斷增加，其確切發(fā)病機(jī)制未明，目前缺乏有效針對(duì)EC的靶向治療方法。葉酸是DNA合成和細(xì)胞生長(zhǎng)的必需物質(zhì)，攝取過量或缺乏均與腫瘤相關(guān)。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)葉酸作用下EC細(xì)胞中的36個(gè)差異基因，通過生存分析發(fā)現(xiàn)FMN1、INHBE、TRIB3和NRBP2基因的表達(dá)對(duì)EC具有生存意義，提示這四個(gè)基因可能參與了葉酸對(duì)EC作用的過程，可能是EC的作用靶標(biāo)。

NRBP2是一種核受體結(jié)合蛋白，研究表明NRBP2與細(xì)胞成瘤性和細(xì)胞凋亡相關(guān)[6]，提示NRBP2可能參與了腫瘤進(jìn)展過程。目前關(guān)于NRBP2與EC的研究較少，本研究的生存分析發(fā)現(xiàn)NRBP2高表達(dá)的EC患者生存率低于低表達(dá)患者，提示NRBP2可能是EC中的一個(gè)促癌基因，與EC的預(yù)后相關(guān)，可能是EC的一個(gè)預(yù)后相關(guān)指標(biāo)。我們通過qPCR和western-blot驗(yàn)證了葉酸作用下EC中NRBP2的表達(dá)下調(diào)，由于葉酸介導(dǎo)的一碳單位與腫瘤相關(guān)，提示葉酸可能通過下調(diào)NRBP2表達(dá)影響EC的進(jìn)展，NRBP2可能是葉酸對(duì)EC的作用靶標(biāo)。NRBP2的下調(diào)對(duì)EC的作用有待深入研究。

抑制素βE(INHBE)是抑制素的一個(gè)亞基，研究發(fā)現(xiàn)INHBE可能參與子宮內(nèi)膜的惡性轉(zhuǎn)化[7]，提示INHBE可能參與腫瘤進(jìn)展過程。本研究的生存分析發(fā)現(xiàn)INHBE可能是EC的一個(gè)促癌基因，與EC的預(yù)后相關(guān)。通過qPCR驗(yàn)證葉酸作用下INHBEmRNA表達(dá)下調(diào)，提示葉酸可能下調(diào)EC中INHBE的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)干擾素上調(diào)EC細(xì)胞中抑制素βE并且發(fā)揮凋亡作用[8]。葉酸對(duì)INHBE的下調(diào)作用可能與EC細(xì)胞的凋亡和腫瘤進(jìn)展相關(guān)，INHBE可能是EC的靶標(biāo)。

TRIB3是一種假激酶，與多種腫瘤進(jìn)展和預(yù)后相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)TRIB3在EC的表達(dá)水平高于正常子宮內(nèi)膜組織，其過表達(dá)促進(jìn)EC細(xì)胞凋亡，并通過調(diào)節(jié)AKT信號(hào)通路抑制其增殖、遷移和侵襲作用[9]，提示TRIB3可能參與EC的進(jìn)展過程，TRIB3可能是EC的治療靶標(biāo)。本研究生存分析發(fā)現(xiàn)TRIB3可能是促癌基因，然而，通過qPCR發(fā)現(xiàn)葉酸作用下TRIB3mRNA表達(dá)無明顯變化，提示葉酸可能并不直接影響TRIB3表達(dá)。由于樣本限制，葉酸對(duì)TRIB3的調(diào)節(jié)作用仍需進(jìn)一步加大樣本驗(yàn)證。

本研究通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、生存分析、qPCR和western blot發(fā)現(xiàn)在EC中葉酸下調(diào)NRBP2的表達(dá)，NRBP2可能是EC的一個(gè)治療靶標(biāo)。INHBE與TRIB3在EC中能否作為潛在治療靶標(biāo)需進(jìn)一步后續(xù)驗(yàn)證，NRBP2、INHBE和TRIB3基因?qū)C的作用有待深入研究。本研究豐富了EC的分子研究，并為EC找到一個(gè)新型的作用靶標(biāo)，可能為EC的診斷和治療提供一條新的思路。