江潔怡 肖觀林 曾志浩 蔡大可

1 廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院/廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣州 510095)

2 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院(廣州 510405)

高脂血癥(hyperlipidemia)是指血漿中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和/或低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)過(guò)高和/或高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)過(guò)低的一種全身脂代謝異常疾病，也稱血脂異常[1]。高脂血癥作為內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，其病癥的發(fā)生與機(jī)體內(nèi)器官的代謝問(wèn)題有關(guān)，如內(nèi)環(huán)境失衡、微生態(tài)調(diào)節(jié)等，但目前臨床上對(duì)高脂血癥的檢測(cè)仍主要停留在 “血脂”這一實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)上，而忽略了其伴隨的其它病理生理的改變。事實(shí)上，在高脂血癥發(fā)病過(guò)程中，不僅會(huì)出現(xiàn)脂代謝的紊亂，還會(huì)出現(xiàn)糖代謝、氨基酸代謝、氧化應(yīng)激及炎癥等，其病癥的出現(xiàn)是多種代謝通路異常，機(jī)體多功能發(fā)生紊亂的綜合結(jié)果[2- 4]。單純的以“血脂”指標(biāo)作為診斷和研究高脂血癥相關(guān)疾病的手段并不全面，容易掩蓋人體內(nèi)分泌系統(tǒng)異常的真正病因，同時(shí)，“血脂”指標(biāo)只能“宣判”結(jié)果而無(wú)法實(shí)現(xiàn)早期診斷。

氨基酸(amino acids)是構(gòu)建機(jī)體蛋白質(zhì)分子的基本組成單位，也是調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝及維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，具有廣泛的生物學(xué)功能，氨基酸的含量檢測(cè)常常作為機(jī)體內(nèi)分泌平衡及相關(guān)器官功能情況的側(cè)面反映與輔診依據(jù)[5- 10]，還可用于疾病的早期診斷[11- 13]。本研究通過(guò)建立食餌性高脂血癥大鼠模型，采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS/MS)法，對(duì)高脂血癥模型大鼠血液中氨基酸譜進(jìn)行測(cè)定，并通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對(duì)比造模前后大鼠血液中氨基酸譜的變化，尋找高脂血癥代謝特異性氨基酸，為高脂血癥臨床早發(fā)現(xiàn)、早治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SD 大鼠20只，SPF 級(jí)，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半，均由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵)2008- 0002。實(shí)驗(yàn)環(huán)境：廣東省中醫(yī)研究所SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，合格證號(hào)SYXK(粵)2010- 0059。所有大鼠均遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求進(jìn)行飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作。

1.2 試藥

高脂飼料(批號(hào)D12492)，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；膽固醇試劑盒(批號(hào)120241)、甘油三酯試劑盒(批號(hào)130441)、高密度脂蛋白膽固醇測(cè)定試劑盒(批號(hào)130521)、低密度脂蛋白膽固醇測(cè)定試劑盒(批號(hào)140561)，中生北控生物科技股份有限公司；非諾貝特膠囊(批號(hào)20667)，法國(guó)利博福尼制藥公司；氨基酸混合對(duì)照品(批號(hào)BCBT9759，天門冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、脯氨酸(Pro)、精氨酸(Arg)、組氨酸(His)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)，(批號(hào)BCBT8201，濃度100 pmol/μL)，美國(guó)Agilent公司；甲醇、甲酸、乙腈(色譜純)，美國(guó)Fisher公司；蒸餾水，廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

1.3 儀器

ExionLC AC液相色譜儀、X500R QTOF質(zhì)譜儀，美國(guó)Sciex公司；XS205DU型電子分析天平，瑞士Mettler TOLEDO公司；JJ3000型動(dòng)物電子秤，美國(guó)G&G 公司；3K30型低溫冷凍離心機(jī)，德國(guó) SIGMA 公司；Varioskan Flash 全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo 公司。

1.4 高脂血癥模型的建立

取SPF級(jí)SD大鼠20只，每組10只，雌雄各半，按體質(zhì)量隨機(jī)均分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組。除正常對(duì)照組外，其余大鼠給予高脂飼料，連續(xù)4周。

1.5 生化指標(biāo)的測(cè)定

禁食24 h，于末次給藥1 h后，眼眶后靜脈叢取血，離心(3000 r/min，10 min)分離血清，部分血清于- 80 ℃冰箱中保存，備用。取血清，采用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定各組大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C含量。

1.6 UPLC-Q-TOF-MS/MS法測(cè)定

1.6.1 供試品溶液的制備 將血清于室溫下解凍溶解，取20 μL血清樣品于EP管中，加280 μL乙腈，渦旋30 s，靜置10 min，離心(13 000 r/min，10 min)，取上清液，即得。

1.6.2 色譜與質(zhì)譜條件 色譜柱：Waters XBridge Amide(150 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：0.2%甲酸甲醇溶液(A)- 0.2%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫：0～3 min，85% A；3～6.5 min，85%～50% A；6.5～9 min，50% A，9～9.1 min，50%～85% A，9.1～15 min，85% A；體積流量0.4 mL/min；柱溫 40 ℃；進(jìn)樣量 1 μL。Sciex X500R QTOF 質(zhì)譜儀，電噴霧離子源(ESI)；采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)進(jìn)行正離子檢測(cè)；霧化氣378.9 kPa，輔助氣 378.9 kPa，氣簾氣 241.1 kPa，霧化溫度 550 ℃，噴霧電壓(ionspray pressure)為5 500 V，優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 優(yōu)化的質(zhì)譜條件參數(shù)

續(xù)表

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對(duì)研究中得到數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組結(jié)果比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 生化指標(biāo)與正常對(duì)照組比較

模型組TC(t′=7.437 8，P<0.001)、TG(t′=14.466 3，P<0.01)、LDL-C(t′=5.498 5，P<0.01)均升高，而HDL-C(t′=11.773 2，P<0.01)降低，說(shuō)明造模成功。見表2。

表2 高脂血癥模型大鼠的生化指標(biāo)

2.2 UPLC-Q-TOF-MS/MS法測(cè)定

2.2.1 線性關(guān)系、檢測(cè)限和定量限 精密吸取氨基酸混合對(duì)照品適量，加甲配制成不同濃度的系列混合對(duì)照品溶液，按“1.6.2”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)Y，對(duì)相應(yīng)的對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)X，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍；分別以信噪比(S/N)約為3和10計(jì)算檢測(cè)限(LOD)及定量限(LOQ)，見表3、圖1。

表3 線性關(guān)系、檢測(cè)限和定量限考察結(jié)果

2.2.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一混合對(duì)照品溶液1 μL，照擬定的條件連續(xù)測(cè)定6次，記錄各峰峰面積，結(jié)果測(cè)得各氨基酸成分峰面積RSD(n=6)均<3%，表明該色譜條件下，儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取制備好的同一供試品溶液1 μL，照擬定的條件，分別在制備樣品后第0、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣，記錄各峰峰面積，結(jié)果各氨基酸成分峰面積RSD(n=6)均<3%，表明樣品溶液24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

圖1 氨基酸成分的MRM提取離子流色譜

表4 高脂血癥模型大鼠血清中氨基酸的變化

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份血清樣品，按“1.6.1”項(xiàng)下方法制備供試品，平行6份，并照擬定的條件測(cè)定，記錄各氨基酸成分峰面積并計(jì)算其含量，結(jié)果各氨基酸成分的平均含量在4.526～28.312 μmol/L，RSD(n=6)均<6%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.2.5 回收率試驗(yàn) 取已知含量的同一份血清樣品6份，分別精密加入等量的氨基酸混合對(duì)照品，按“1.6.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照擬定的條件測(cè)定，記錄各峰峰面積并計(jì)算含量結(jié)果，計(jì)算回收率。結(jié)果各氨基酸成分的平均回收率分別在96.13%～103.93%，RSD(n=6)均<6%。

2.2.6 樣品測(cè)定 取各血清樣品，按“1.6.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照擬定的條件測(cè)定，記錄各峰峰面積并計(jì)算含量結(jié)果。結(jié)果除Asp、Leu、Ile、Tyr、Arg、His、Glu、Lys在供試品中含量太低，未檢測(cè)到，其余8種氨基酸成分均被檢測(cè)到。經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)：與正常對(duì)照組比較，模型組Met、Phe、Thr、Val五種氨基酸均有降低(t=5.658，2.918，3.486，6.319，P<0.001，0.009，0.003，<0.001)，Pro(t′=4.453，P=0.001)和Gly(t′=2.551，P=0.024<0.01)均有降低，而Ser和Ala均無(wú)差異(t=0.789，0.277，P=0.441，0.785>0.05)。結(jié)果見表4。

3 討 論

筆者曾對(duì)C18反相色譜柱進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)氨基酸大多為大極性化合物，在C18柱上保留較弱，而氨基柱對(duì)氨基酸的保留較好，故選擇氨基柱；在流動(dòng)相的考察中，發(fā)現(xiàn)甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)，部分氨基酸的信號(hào)較弱，加入甲酸后，增加了氨基酸的電離，信號(hào)增強(qiáng)；考察了35 ℃、40 ℃、45 ℃三種不同柱溫對(duì)分離效果的影響，結(jié)果柱溫40 ℃以上時(shí)，信號(hào)較穩(wěn)定，故最終選柱溫為40 ℃；考察了0.35 mL/min、0.40 mL/min、0.45 mL/min 三種流速對(duì)分離效果的影響，結(jié)果流速對(duì)分離效果影響不大，綜合分析時(shí)間及儀器耐用性，選0.40 mL/min作為分析流速。最終所建立的含量測(cè)定方法專屬性高，分離度好。

樣品測(cè)試時(shí)，部分氨基酸信號(hào)較低，無(wú)法達(dá)到檢出限，可能與取樣濃度較低有關(guān)，后續(xù)可加強(qiáng)樣品的濃度，提高低濃度樣品的檢出，使檢測(cè)更加準(zhǔn)確。

高脂血癥是一種內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，其病癥的出現(xiàn)是多種代謝通路異常、機(jī)體多功能發(fā)生紊亂的綜合結(jié)果，其中氨基酸代謝異常，是內(nèi)分泌失衡及相關(guān)器官功能紊亂的重要輔證。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了高脂血癥模型大鼠血液中的14種氨基酸的含量，可以從整體水平上反映高脂血癥建模前后氨基酸代謝變化，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)一步印證了高脂血癥大鼠存在氨基酸代謝的紊亂，其中Met、Phe、Pro、Thr、Val、Gly等6種氨基酸為其潛在的生物標(biāo)志物，其中蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、蘇氨酸(Thr)、纈氨酸(Val)是人類、其他哺乳動(dòng)物和禽類正常生長(zhǎng)發(fā)育所必需的氨基酸(有9種必需氨基酸)，而蛋氨酸是體內(nèi)主要的甲基供體，苯丙氨酸是多種神經(jīng)遞質(zhì)的前體，蘇氨酸是一種免疫刺激劑，可促進(jìn)細(xì)胞免疫防御功能，纈氨酸能促進(jìn)身體正常生長(zhǎng)，修復(fù)組織，調(diào)節(jié)血糖，并提供需要的能量；脯氨酸(Pro)是由谷氨酸合成的非必需氨基酸，是膠原蛋白的重要組成部分，也是潛在的內(nèi)源性興奮毒素/神經(jīng)毒素；甘氨酸(Gly)屬于非極性氨基酸，參與人體的DNA，磷脂和膠原蛋白的生產(chǎn)以及能量的釋放。該結(jié)果為高脂血癥臨床早發(fā)現(xiàn)、早治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)；本研究所建立的氨基酸測(cè)定方法穩(wěn)定、可靠，為氨基酸及其結(jié)構(gòu)類似物在復(fù)雜體系中的檢測(cè)的提供了參考。