廖光華 代佳君 鄧鈺蓱 吳自豪 任 強(qiáng) 陳 偉,*

（1塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾843300）

（2塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾843300）

奶牛乳腺炎是嚴(yán)重影響奶牛業(yè)健康發(fā)展的多發(fā)病之一。據(jù)報(bào)道，臨床型乳腺炎的平均發(fā)病率為33. 41%，隱性乳腺炎奶牛的平均每頭陽(yáng)性率為73. 91%。病原菌的感染是引起牛乳房炎的主要原因，而傳染性病原菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，以下簡(jiǎn)稱金葡菌）就是主要致病菌之一。金葡菌引起的奶牛乳腺炎，由于引發(fā)產(chǎn)奶量下降、奶品質(zhì)降低、治療成本升高和高死亡率而導(dǎo)致巨大經(jīng)濟(jì)損失［1,2］。因此，快速鑒定金葡菌可為治療奶牛臨床乳腺炎提供重要用藥依據(jù)。在分子生物學(xué)鑒定方法建立起來(lái)之前，人們用傳統(tǒng)的生化試驗(yàn)完成細(xì)菌鑒定。但隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的生化試驗(yàn)往往會(huì)因?yàn)椴僮鞯膹?fù)雜性和操作過(guò)程中對(duì)試驗(yàn)條件掌控的精準(zhǔn)性，從而引起試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差或者無(wú)法直接判斷［3］，并且同一種屬的不同菌株間性狀可能不同、同一菌株在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果也可能不同，這導(dǎo)致相當(dāng)高的誤判幾率［4,5］，且傳統(tǒng)鑒定結(jié)果隨著分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，有些菌種重新進(jìn)行了分類，其分類地位發(fā)生了變化，更加顯示出傳統(tǒng)生化鑒定的缺點(diǎn)［5］。因此隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究者們提出了采用16S rRNA 基因序列分析這一分子生物學(xué)的鑒定方法，該方法較傳統(tǒng)意義上的生化鑒定更為準(zhǔn)確。16S rRNA 擴(kuò)增使用的引物是細(xì)菌的通用引物，擴(kuò)增的序列是細(xì)菌高度保守的16S rRNA基因部分片段。由于擴(kuò)增片段高度保守，因此擴(kuò)增完成后還需要進(jìn)行測(cè)序比對(duì)才能確定細(xì)菌的種類，不僅增加了細(xì)菌鑒定的成本，而且延長(zhǎng)了細(xì)菌鑒定的時(shí)間。因此，針對(duì)金葡菌特有的基因擴(kuò)增，可解決金葡菌PCR快速檢測(cè)的問(wèn)題。

研究發(fā)現(xiàn)金葡菌含有nuc 基因，編碼的耐熱核酸酶( Thermostable nuclease, Thermonuclease，TNase) 不僅是金葡菌所特有，而且在不同菌株之間具有較高的保守性［6,7］。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)金葡菌nuc 基因有潛在增強(qiáng)其耐藥性的能力，加劇了公共安全用藥的緊張形勢(shì)［8］。因此，依賴于nuc基因的特異性，建立靈敏度高、特異性強(qiáng)的PCR 鑒定方法，可用于臨床快速鑒定金葡菌，為臨床用藥指導(dǎo)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。與此同時(shí)，該基因作為金葡菌的獨(dú)特毒力因子可為進(jìn)一步研究金葡菌的耐藥性與毒素之間的關(guān)系提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品

來(lái)自新疆巴州地區(qū)某奶牛場(chǎng)隨機(jī)選擇39 頭奶牛，每頭牛每個(gè)乳區(qū)10 ml 乳樣，共采集111 份乳樣，放入無(wú)菌試管中，保存于4℃冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，立即進(jìn)行分離。金葡菌（Staphylococcus aureus，ATCC 25923）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis，ATCC 35984，以下簡(jiǎn)稱表葡菌)、大腸桿菌（Escherichia coli，S17-1）、乳房鏈球菌（Streptococcus uberis）及健康兔血由塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要試劑及儀器

Tris、SDS、EDTA、16S rRNA 擴(kuò)增引物、nuc 基因擴(kuò)增引物［9,10］（見(jiàn)表1）、dNTP、Easy Taq 酶、Easy Taq buffer，均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；PCR 儀、凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀購(gòu)自Bio-Rad公司。

表1 引物名稱及序列

1.1.3 培養(yǎng)基

MSA 培養(yǎng)基（用于選擇性劃線分離培養(yǎng)金葡菌），MSB 培養(yǎng)基（用于選擇性增菌培養(yǎng)），LB 培養(yǎng)基（用于溶血試驗(yàn)中兔血平皿的配制），MHA 培養(yǎng)基（OXOID,UK）

1.2 方法

1.2.1 葡萄球菌的分離、鑒定與保存

從采集的乳樣中吸取100μL 乳樣分別加入到已進(jìn)行高壓滅菌裝有5 ml MSB 培養(yǎng)基的試管中，并對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)的編號(hào)后，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36-72 h 后，接種到MSA 培養(yǎng)基上，再次置于37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)18-24 h。挑取疑似葡萄球菌的優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行革蘭染色、鏡檢，確定為葡萄球菌后，進(jìn)行甘油管-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 生化試驗(yàn)

1.2.2.1 觸酶試驗(yàn)

一張潔凈的載玻片上少量3% H2O2，用接種環(huán)取少量的待檢細(xì)菌均勻涂抹于過(guò)3% H2O2液面之下，30 s 內(nèi)觀察有無(wú)氣泡的產(chǎn)生。如果產(chǎn)生氣泡，則為陽(yáng)性（+），反之則為陰性（-）［11］。試驗(yàn)過(guò)程中同時(shí)在載玻片上做陽(yáng)性對(duì)照（金葡菌ATCC 25923）和生理鹽水對(duì)照。

1.2.2.2 血漿凝固酶試驗(yàn)

在潔凈的載玻片上滴加滅菌的生理鹽水1滴，用接種環(huán)挑取少量的細(xì)菌漂浮于生理鹽水中，然后滴加兔的血漿1滴，將其充分混勻，如果細(xì)菌凝集成塊，則為陽(yáng)性（+）反之則為陰性（-）［11］。試驗(yàn)過(guò)程中同時(shí)在載玻片上做陽(yáng)性對(duì)照（金葡菌ATCC 25923）和生理鹽水對(duì)照。

1.2.2.3 溶血試驗(yàn)

制備普通瓊脂（LB）培養(yǎng)基，置于高壓滅菌鍋121℃，20 min 滅菌后，冷卻至50℃左右，加入無(wú)菌的兔血，含量為5%即每95 ml 培養(yǎng)基加入5 ml 血液，充分混勻。將血瓊脂倒入滅好菌的平皿中至平皿凝固后將活化好的純化培養(yǎng)分離凍存的葡萄球菌接種到血平板上；置于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24 h，觀察并記錄結(jié)果［11］。如果有溶血圈，則為陽(yáng)性（+）反之則為陰性（-）。試驗(yàn)過(guò)程中同時(shí)做陽(yáng)性對(duì)照（金葡菌ATCC 25923）。

1.2.2.4 甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)

取甘油凍存的分離株接種于高鹽甘露醇瓊脂（MSA）培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18-24 h后觀察。如果菌落周?chē)杉t色變?yōu)辄S色則表示發(fā)酵甘露醇為陽(yáng)性（+），未變?yōu)辄S色依舊為紅色則表示未發(fā)酵甘露醇為陰性（-）試驗(yàn)過(guò)程中同時(shí)做陽(yáng)性對(duì)照（金葡菌ATCC 25923）。

1.2.3 金葡菌16S rRNA及nuc基因鑒定

從通過(guò)鏡檢篩選為葡萄球菌的菌株中隨機(jī)選取50 株葡萄球菌進(jìn)行16S rRNA 基因擴(kuò)增測(cè)序和nuc 基因擴(kuò)增，同時(shí)以非葡萄球菌的大腸桿菌和乳房鏈球菌、表葡菌ATCC35984和金葡菌ATCC25923作對(duì)照，并送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行BLAST比對(duì)。本實(shí)驗(yàn)采用50 μl 16S rRNA PCR 擴(kuò)增體系：ddH2O(40. 7 μl）、Easy Taq 酶（0. 3 μl）、Easy Taq buffer（5 μl）、dNTP（1 μl）、引 物27F 及1492R 各1 μl。+1 min、55℃退火30 s、72℃延伸2 min、72℃總延伸10 min。同時(shí)采用相同的PCR 擴(kuò)增體系用于nuc基因擴(kuò)增，選用引物見(jiàn)表1。nuc 基因擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min、94℃變性1 min、55℃褪火30 s、72℃延伸1. 5 min、進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72℃總延伸3.5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 金葡菌的分離鑒定

從所采的111 份奶牛乳樣品中分離出205 株疑似葡萄球菌菌株，經(jīng)生化試驗(yàn)鑒定得到金葡菌98株，分離率達(dá)到47. 8%。205 株細(xì)菌生化試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表2所示。

2.2 16S rRNA及nuc基因序列分析

根據(jù)鏡檢結(jié)果，從中隨機(jī)選取了50 株葡萄球菌進(jìn)行16S rRNA 基因的擴(kuò)增與測(cè)序，同時(shí)進(jìn)行nuc 基因PCR 檢測(cè)，以金葡菌ATCC 25923、表葡菌ATCC 35984、乳房鏈球菌、大腸桿菌S17-1 進(jìn)行nuc 基因PCR 擴(kuò)增。結(jié)果表明，其中有40 株能擴(kuò)增出單一的約279 bp nuc基因條帶的葡萄球菌菌株，其16S rRNA基因測(cè)序比對(duì)結(jié)果均為金葡菌。而10株未擴(kuò)增出單一目的條帶的葡萄球菌，其16S rRNA 基因測(cè)序比對(duì)結(jié)果均不是金葡菌，分別為溶血性葡萄球菌（6 株）、腐生葡萄球菌（3株）和解淀粉葡萄球菌（1株）。通過(guò)對(duì)擴(kuò)增的279 bp nuc 基因進(jìn)行克隆測(cè)序比對(duì)，均為金葡菌nuc 基因片段，且同源性為100%。作為對(duì)照菌株的表葡菌ATCC 35984 擴(kuò)增出兩條條帶，一條大于279 bp，另一條小于279 bp（見(jiàn)圖1）。乳房鏈球菌擴(kuò)增出多條不同大小的雜亂條帶，而大腸桿菌沒(méi)有擴(kuò)增出任何條帶。上述結(jié)果表明nuc 基因具有高度特異性，通過(guò)對(duì)nuc基因擴(kuò)增即可鑒定金葡菌。

表2 205株細(xì)菌生化試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

圖1 nuc基因電泳圖

3 結(jié)論與討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展, 通過(guò)細(xì)菌保守序列PCR 擴(kuò)增來(lái)確定其種類的方法被越來(lái)越多的應(yīng)用于病原微生物的分離鑒定。本實(shí)驗(yàn)采用高鹽甘露醇培養(yǎng)法，篩選出205株葡萄球菌。為建立一種更快速高效的分子生物學(xué)鑒定方法，隨機(jī)選取50 株葡萄球菌，采用16S rRNA 擴(kuò)增測(cè)序和nuc 基因擴(kuò)增以鑒定細(xì)菌的種類。結(jié)果顯示，其中16S rRNA 擴(kuò)增測(cè)序結(jié)果為金葡菌的40株菌，均擴(kuò)增出清晰的、與預(yù)期片段大小相符合的nuc 基因。而未擴(kuò)增出清晰的、與預(yù)期片段大小相符合的nuc 基因的10 株菌均為非金葡菌。同時(shí)用已知的表葡菌、乳房鏈球菌和大腸桿菌作對(duì)照，前兩者擴(kuò)增出多條非目的條帶，而大腸桿菌未擴(kuò)增出任何條帶。進(jìn)一步表明nuc 基因的特異性擴(kuò)增不僅可區(qū)別革蘭陽(yáng)性菌的葡萄球菌屬和革蘭陰性菌的大腸桿菌屬，也可區(qū)別同屬革蘭陽(yáng)性菌的葡萄球菌和鏈球菌，更可區(qū)別同屬葡萄球菌屬的金葡菌與表葡菌，從而實(shí)現(xiàn)特異性擴(kuò)增來(lái)快速鑒定金葡菌。這一結(jié)果表明，依賴金葡菌nuc基因的PCR 擴(kuò)增具有高特異性、高效性的特點(diǎn)，可作為金葡菌特異性檢測(cè)的分子生物學(xué)方法。在本實(shí)驗(yàn)中，為了確定金葡菌nuc 基因PCR 擴(kuò)增的特異性，我們還結(jié)合了16S rRNA 基因測(cè)序方法，以確定本實(shí)驗(yàn)建立的方法是否準(zhǔn)確。結(jié)果表明凡是擴(kuò)增出單一279 bp 條帶的菌株，其16S rRNA 基因測(cè)序結(jié)果均為金葡菌。而非金葡菌要么無(wú)法擴(kuò)增出任何條帶，要么擴(kuò)增出的條帶不是預(yù)期大小，我們能從電泳圖上很清楚地判斷出來(lái)。16S rRNA 基因序列分析在菌種鑒定中是一種有效的方法，但這種方法分析的是細(xì)菌高度保守序列，常用于分析不同原核生物間的親緣關(guān)系［12］，但與金葡菌nuc 基因檢測(cè)靶點(diǎn)的鑒定方法相比區(qū)分度較低［13］。而nuc基因是金葡菌特有的毒力基因，其他非金葡菌菌種不含該基因，所以可以作為特定的靶標(biāo)基因用于金葡菌鑒定。因此，nuc 基因?yàn)榻鹌暇蔫b定提供了更有價(jià)值的方法，同時(shí)因不需要測(cè)序，則大大縮短了細(xì)菌鑒定的時(shí)間和成本，為及時(shí)臨床用藥治療提供了保障［14］。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，該基因有潛在增強(qiáng)金葡菌耐藥性的能力，可影響公共衛(wèi)生安全［8］。利用nuc 基因高度特異性的特點(diǎn)，不僅建立了一種特異性強(qiáng)、靈敏度高的金葡菌快速鑒定方法，同時(shí)對(duì)進(jìn)一步研究nuc 基因在奶牛乳房炎發(fā)生發(fā)展中的作用也有一定的意義。