侯建業(yè)，魯濤，李金利，陳利軍*

(1.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，信陽(yáng) 464000；2.信陽(yáng)市農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)管理指導(dǎo)站，信陽(yáng) 464000)

近年來(lái)，多篇文章報(bào)道了植物揮發(fā)油具有明顯的抗植物病原真菌、細(xì)菌的功能[1-4]，且已有以揮發(fā)油為活性成分的殺菌劑商品問(wèn)世[5-6]。植物揮發(fā)油的抗菌活性與揮發(fā)油化學(xué)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[7-8]。因此，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)鑒定野生植物揮發(fā)油的化學(xué)組分[9]并研究其抑菌活性具有重要意義。

紅蓼 (PolygonumodentaleL.)是蓼科野生植物，分布廣泛，我國(guó)各省區(qū)都有生長(zhǎng)。蓼科植物藥理學(xué)活性多樣，是重要的傳統(tǒng)藥物資源。紅蓼的成熟果實(shí)，又名水紅花子，始載于1977年版《中國(guó)藥典》，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥之一。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)該科植物具有抗微生物、殺蟲(chóng)、抗氧化和抗腫瘤等多種生物活性，具有祛風(fēng)利濕，散瘀止痛, 解毒消腫等功效; 主要用于痢疾、腸胃炎、腹瀉、腳氣、疥癬、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛及跌打腫痛的治療; 外用治毒蛇咬傷、皮膚濕疹等[10]。為推動(dòng)紅蓼植物資源的開(kāi)發(fā)利用, 本文作者采用共水蒸餾法對(duì)野生紅蓼揮發(fā)油的化學(xué)成分進(jìn)行了提取，采用氣相色譜-質(zhì)譜 (GC -MS)對(duì)揮發(fā)油的主要化學(xué)成分進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試植物 植物揮發(fā)油的研究較為普遍且涉及面較廣，本文以信陽(yáng)地區(qū)野生紅蓼為研究對(duì)象。紅蓼于2019年4月采自信陽(yáng)市北湖，取地上部分進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備 JC101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(產(chǎn)自余姚市金惠電子設(shè)備廠)；LRHS-150B恒溫恒濕培養(yǎng)箱(產(chǎn)自上海試驗(yàn)設(shè)備有限公司)；6850/5975型氣質(zhì)聯(lián)用儀GC-MS(美國(guó)安捷倫公司)；譜圖庫(kù)為NIST14；KDM-2000型電熱套(產(chǎn)自金壇市恒豐儀器制造有限公司)；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)；JA5003型千分之一天平(上海良平儀器儀表有限公司)；立式壓力蒸汽滅菌器(產(chǎn)自山東新華醫(yī)療器械有限公司)；BOD-2588-258L型冰箱(產(chǎn)自青島海爾)。

1.1.3 供試植物病原菌 試驗(yàn)所用的植物病原菌主要為儲(chǔ)藏期病害和土傳病害的病原真菌，本實(shí)驗(yàn)采用的是番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)。

1.1.4 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基：去皮后的馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂19 g、水1000 ml。

1.2 方法

1.2.1 植物揮發(fā)油的提取 利用水蒸氣蒸餾法提取紅蓼中的揮發(fā)油。即將所采植物剪成3cm長(zhǎng)的小段，放進(jìn)5000ml的圓底蒸餾燒瓶中，在100℃的溫度下連續(xù)蒸1～2 h后，將揮發(fā)油放入收集瓶中，并于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 揮發(fā)油GC-MS條件分析 色譜條件；色譜柱為HP-5 ms毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度260℃；程序升溫，初始柱溫為60℃，保持2min，以10℃/min升溫速率升至230℃，保持1 min；載氣為高純度氦氣，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為1.0 μL，不分流，進(jìn)樣前可用適當(dāng)乙醚進(jìn)行稀釋。

質(zhì)譜條件: EI離子源，電子能量70 eV，離子阱溫度220℃，傳輸線溫度280℃，溶劑延遲時(shí)間為2 min，全掃描方式，掃描范圍33～350amu。

1.2.3 生長(zhǎng)速率法測(cè)抑菌活性 用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定植物揮發(fā)油對(duì)植物病原菌的熏蒸抑制作用。將加熱后的培養(yǎng)基倒入滅菌后的90 mm培養(yǎng)皿中，然后取均勻長(zhǎng)滿菌絲的PDA培養(yǎng)基上的供試菌種，用直徑為5 mm的無(wú)菌打孔器打取長(zhǎng)勢(shì)一致的菌餅，用經(jīng)過(guò)滅菌的挑針將菌餅依次接種至冷卻后的培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)皿蓋中間放置已滅菌的12 mm濾紙片，并依次滴加等量梯度揮發(fā)油，以僅放一濾紙片不滴加揮發(fā)油為對(duì)照。各濃度梯度分別重復(fù)3次。每個(gè)培養(yǎng)皿接種菌餅1塊，置25 ℃的生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h后，用十字交叉法測(cè)量處理組和對(duì)照組菌落直徑，計(jì)算處理濃度對(duì)真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制百分率。

抑菌率(%)=(對(duì)照菌落生長(zhǎng)直徑-處理菌落生長(zhǎng)直徑)×100/對(duì)照菌落生長(zhǎng)直徑

2 結(jié)果與分析

圖1紅蓼揮發(fā)油的GC-MS總離子流圖

2.1 紅蓼揮發(fā)油的組分GC-MS分析

用GC-MS分析紅蓼中揮發(fā)油化學(xué)組分的總離子流(圖1)。根據(jù)氣相色譜峰面積歸一法確定各化學(xué)組分的相對(duì)含量，所得質(zhì)譜圖經(jīng)NIST14數(shù)據(jù)庫(kù)檢索化合物，與標(biāo)準(zhǔn)圖譜核對(duì)并結(jié)合CAS號(hào)分析鑒定各組分(表1)。

紅蓼揮發(fā)油共有39 個(gè)化學(xué)組分。鑒定出31 個(gè)組分，從表1中可看出其主要成分為α-瓊脂呋喃(19.488%)、1-氯-5-甲基己烷(14.851%)和α-衣蘭油烯(10.053%)。

表1 紅蓼揮發(fā)油的組成成分

表1(續(xù))

2.2 紅蓼揮發(fā)油對(duì)番茄灰霉病菌的熏蒸抑制作用

圖2紅蓼揮發(fā)油對(duì)番茄灰霉病菌的抑制熏蒸作用

用生長(zhǎng)速率法測(cè)定紅蓼揮發(fā)油對(duì)植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的熏蒸抑制作用，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2和表2。由表2可知，紅蓼植物揮發(fā)油對(duì)供試病原菌具有一定的熏蒸抑制作用，試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)抑制作用隨揮發(fā)油劑量增加而增強(qiáng)。在16 μL/皿計(jì)量時(shí)，對(duì)番茄灰霉病菌的抑菌率為19.231%，在 24 μL/皿計(jì)量時(shí)，對(duì)番茄灰霉病菌的抑菌率為36.154%。

表2 種植物揮發(fā)油對(duì)番茄灰霉病菌的熏蒸抑制作用

3 結(jié)論和討論

本研究通過(guò)水蒸氣蒸餾法提取紅蓼中的揮發(fā)油，采用GC-MS 對(duì)紅蓼揮發(fā)油化學(xué)組分進(jìn)行分離鑒定，鑒定出31種化合物, 占揮發(fā)油總量的94.810%，比已報(bào)道的吉林市郊野生紅蓼揮發(fā)油化學(xué)組分多出13種，主要組分為α-瓊脂呋喃(19.488%)、1-氯-5-甲基己烷(14.851%)、α-衣蘭油烯(10.053%)。與東北[10]49等地產(chǎn)紅蓼揮發(fā)油的主要化學(xué)組分大有不同，主要區(qū)別在于本研究鑒定出的含量最高的成分α-瓊脂呋喃(19.488%)在其它紅蓼揮發(fā)油的研究中未見(jiàn)報(bào)道，這些區(qū)別可能與試驗(yàn)材料的生境、采收時(shí)間、前處理方式等因素有關(guān)。

本文研究發(fā)現(xiàn)紅蓼中的揮發(fā)油對(duì)番茄灰霉病菌具有一定的抑制作用，其抑菌率隨著揮發(fā)油劑量增大而增強(qiáng)。課題組后續(xù)研究紅蓼揮發(fā)油最佳抑菌條件，力爭(zhēng)為綠色環(huán)保的植物病害防控熏蒸劑的研制提供有力的理論依據(jù)。