鞏元帥 宋靜靜2 古小超

(1.天津市生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，天津 300191；2.天津市環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究院，天津 300191)

富營(yíng)養(yǎng)化是國(guó)內(nèi)河流湖泊普遍面臨的主要環(huán)境問(wèn)題，對(duì)藻類(lèi)等浮游植物生長(zhǎng)及藻華暴發(fā)具有重要的影響[1]。葉綠素a是藻類(lèi)等浮游植物光合作用色素，是表征水體中浮游植物生物量的重要監(jiān)測(cè)指標(biāo)之一，廣泛應(yīng)用于河流湖泊水質(zhì)評(píng)價(jià)和富營(yíng)養(yǎng)化評(píng)價(jià)。目前葉綠素a 的測(cè)定方法有熒光法、分光光度法、高效液相色譜法、遙感法等，其中分光光度法是國(guó)內(nèi)測(cè)定葉綠素a的標(biāo)準(zhǔn)方法，該方法測(cè)定簡(jiǎn)單，但人工提取葉綠素和測(cè)定過(guò)程較為繁瑣[2]。與分光光度法相比，熒光法可以不受采樣時(shí)間和地點(diǎn)的限制，消除取樣、保存、測(cè)量過(guò)程中人為因素的影響，可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)大批量、連續(xù)快速測(cè)定葉綠素a的含量[3]。目前，在湖泊、海洋水質(zhì)在線監(jiān)測(cè)中，基于熒光法的葉綠素a監(jiān)測(cè)儀應(yīng)用較為廣泛。

1 熒光法基本原理

葉綠素是一種酯類(lèi)化合物，是由葉綠酸和甲醇、葉醇酯化反應(yīng)而生成。葉綠素作為一種熒光物質(zhì)，受光照后，其分子吸收了和它特征頻率相一致的光，躍遷到能量較高的激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，返回能量較低的基態(tài)時(shí)，釋放相應(yīng)的能量產(chǎn)生熒光。當(dāng)葉綠素a經(jīng)波長(zhǎng)為450nm左右的藍(lán)光照射后，會(huì)激發(fā)出波長(zhǎng)為680nm左右的紅光，通過(guò)檢測(cè)激發(fā)光的熒光強(qiáng)度，來(lái)計(jì)算葉綠素a的含量[4]。

2 熒光法影響因素

2.1 外界環(huán)境因素的影響

2.1.1 濁度

熒光法是通過(guò)測(cè)定水樣經(jīng)過(guò)光照后產(chǎn)生熒光的強(qiáng)度計(jì)算葉綠素a的濃度。水樣中顆粒物、懸浮物等物質(zhì)會(huì)影響光在水樣中的傳播，使激發(fā)光和熒光發(fā)生反射、散射等，對(duì)熒光測(cè)定結(jié)果造成影響。研究表明，濁度對(duì)葉綠素a測(cè)定的影響主要分為懸浮物自身產(chǎn)生熒光的熒光效應(yīng)及對(duì)光線遮擋的遮蔽效應(yīng)，兩者均會(huì)對(duì)熒光測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響[5]。葉陳軍等[3]探討了熒光效應(yīng)和遮蔽效應(yīng)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，并根據(jù)實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)提供一種葉綠素?zé)晒庥?jì)基于濁度的修正方法，校準(zhǔn)后的熒光值與真實(shí)葉綠素?zé)晒庵递^為接近。

2.1.2 pH值

pH值是藻類(lèi)生長(zhǎng)過(guò)程中最重要的影響因子之一，pH值對(duì)微藻細(xì)胞生長(zhǎng)和油脂積累的影響主要在于改變細(xì)胞膜電荷和營(yíng)養(yǎng)物的離子化程度，進(jìn)而改變細(xì)胞的活性。 水體中過(guò)酸過(guò)堿的環(huán)境條件會(huì)干擾藻類(lèi)細(xì)胞對(duì)物質(zhì)的吸收，影響其生長(zhǎng)代謝活性及葉綠素產(chǎn)量，對(duì)熒光特性產(chǎn)生一定的影響。呂鵬翼[4]在研究pH值對(duì)葉綠素現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)儀測(cè)定結(jié)果影響中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH值在中性范圍內(nèi)時(shí)，銅綠微囊藻測(cè)定值變化較小，酸性或堿性測(cè)定誤差增大。薄香蘭等[6]以小球藻為研究對(duì)象，研究不同pH值對(duì)其葉綠素?zé)晒?、葉綠素含量和細(xì)胞密度的影響，結(jié)果表明pH值為7時(shí)，熒光活性最高，pH值為9時(shí)，熒光活性下降。

2.1.3 水溫

熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度受溫度影響較大。當(dāng)溫度降低時(shí)，熒光物質(zhì)分子躍遷吸收的能量越高，回到基態(tài)時(shí)，釋放的熒光量子越高，熒光強(qiáng)度越高；溫度升高時(shí)則相反[7]。藻類(lèi)等浮游植物自身受環(huán)境溫度影響較大，當(dāng)溫度變化時(shí)，活體藻結(jié)構(gòu)、光合速率或葉綠體的微環(huán)境發(fā)生了改變，從而影響了葉綠素a的熒光特性。呂鵬翼等[8]研究了溫度對(duì)斜生柵藻、蛋白核小球藻及銅綠微囊藻熒光強(qiáng)度的影響，并計(jì)算了溫度系數(shù)，結(jié)果表明隨著溫度升高，3種活體藻熒光強(qiáng)度均下降。

2.1.4 水樣濃度

熒光法測(cè)定溶液物質(zhì)含量時(shí)，在一定濃度范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度與溶液濃度成正比，可根據(jù)熒光強(qiáng)度換算出溶液中熒光物質(zhì)的含量，對(duì)于濃度較高的溶液，熒光強(qiáng)度與濃度不成線性關(guān)系。當(dāng)溶液濃度過(guò)高時(shí)，一方面會(huì)導(dǎo)致激發(fā)光透光性減弱，另一方面會(huì)發(fā)生熒光自猝滅和熒光再吸收現(xiàn)象，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低[7]。所以，在利用熒光法現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定水體中葉綠素a的濃度時(shí)，在藻類(lèi)濃度較高時(shí)，需適當(dāng)進(jìn)行稀釋處理。

2.1.5 其他色素

在藻類(lèi)等浮游植物葉綠素分子中，除了葉綠素a，還存在葉綠素b和葉綠素c。其中葉綠素a和葉綠素b在化學(xué)性質(zhì)上具有一定的相似性，兩者的激發(fā)和發(fā)射光譜存在明顯的重疊。因此，在利用熒光法現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定水體中葉綠素a的濃度時(shí)，需對(duì)測(cè)定的熒光強(qiáng)度進(jìn)行修正，扣除葉綠素b所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度。為提高測(cè)量精度，許多專(zhuān)家學(xué)者利用同步熒光法測(cè)定葉綠素a含量，研究表明，測(cè)定結(jié)果基本不受其他色素干擾。

2.2 擬合模型

熒光法測(cè)定水體中葉綠素a，一般采用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線法進(jìn)行計(jì)算，該方法簡(jiǎn)單，對(duì)于水質(zhì)干凈、常年變化穩(wěn)定的水體，能較好地反映出熒光強(qiáng)度與葉綠素a濃度之間的關(guān)系。但在實(shí)際應(yīng)用中工作曲線并非完全是線性的，對(duì)于復(fù)雜的水體，線性擬合會(huì)導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果出現(xiàn)較大誤差。因此，為解決這類(lèi)問(wèn)題，將偏最小二乘法、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、支持向量回歸等方法應(yīng)用到模型擬合中。但這些方法計(jì)算較為復(fù)雜，在擬合過(guò)程中需要較多的測(cè)量數(shù)據(jù)，建立過(guò)程比較繁瑣。

2.3 運(yùn)行維護(hù)

在水質(zhì)自動(dòng)監(jiān)測(cè)中，采用熒光法的葉綠素a在線監(jiān)測(cè)儀進(jìn)行監(jiān)測(cè)，具有測(cè)定快捷、維護(hù)簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，適用于飲用水、海洋葉綠素a的監(jiān)測(cè)。但受水體中微生物影響，儀器表面容易附著浮游植物及動(dòng)物，受其生命活動(dòng)影響，會(huì)加速儀器老化，導(dǎo)致生物腐蝕 ，影響儀器測(cè)量的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。在對(duì)儀器的日常維護(hù)工作中，根據(jù)運(yùn)行要求，工作人員應(yīng)及時(shí)清理儀器表面附著的微生物，使儀器保持干凈。定期對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)，開(kāi)展實(shí)驗(yàn)室比對(duì)，確保儀器穩(wěn)定運(yùn)行。當(dāng)發(fā)現(xiàn)儀器損壞時(shí)及時(shí)進(jìn)行更換備件，保證監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)的連續(xù)性和完整性。

3 結(jié) 語(yǔ)

熒光法在水質(zhì)較好的水體中測(cè)定結(jié)果較為準(zhǔn)確，當(dāng)水質(zhì)較差時(shí)，由于影響因子較多，熒光法測(cè)定誤差則會(huì)增大。為減小環(huán)境因子對(duì)監(jiān)測(cè)儀器的影響，應(yīng)做好以下工作：?加強(qiáng)監(jiān)測(cè)儀器維護(hù)，尤其在夏季，保持儀器表面清潔干凈；?采用溫度補(bǔ)償、濁度補(bǔ)償?shù)确绞?，消除水溫變化、懸浮顆粒等對(duì)葉綠素a測(cè)定結(jié)果的影響；?利用同步熒光等對(duì)測(cè)試方法進(jìn)行優(yōu)化，扣除葉綠素b對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響；?在擬合模型建立過(guò)程中，對(duì)比研究偏最小二乘法、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、支持向量回歸等方法在葉綠素測(cè)定中的應(yīng)用，提高計(jì)算結(jié)果準(zhǔn)確度。

利用熒光法可快速實(shí)現(xiàn)水體中葉綠素a含量的測(cè)定，與實(shí)驗(yàn)室分光光度法相比，操作簡(jiǎn)單、時(shí)效性強(qiáng)，可節(jié)省人力、物力。隨著地表水資源、海洋環(huán)境保護(hù)力度的不斷加強(qiáng)，水體富營(yíng)養(yǎng)化監(jiān)測(cè)工作將愈加重要，熒光法在葉綠素a測(cè)定中的應(yīng)用將越來(lái)越廣泛。