楊 璐，陸耀飛

（上海體育學院 運動科學學院， 上海200438）

骨骼肌損傷是運動中常見的運動性損傷疾病，以疼痛、局部腫脹、肌張力降低、功能障礙為主要表現(xiàn)。在運動引起的損傷中，骨骼肌損傷的發(fā)生率為10%～55% 不等，由于骨骼肌再生能力有限，導致自然修復效果不佳，嚴重影響患者的生活質量（Herridge et al.，2003）。因此，提高肌肉恢復能力和改善肌肉損傷后的治療方法具有重要的臨床價值。

骨骼肌衛(wèi)星細胞作為肌源干細胞已被廣泛研究。骨骼肌的損傷修復依賴于骨骼肌衛(wèi)星細胞的激活、增殖、分化。有研究者發(fā)現(xiàn)，運動能夠激活骨骼肌衛(wèi)星細胞并且促進其增殖（Pallafacchina et al.，2013）。機械牽拉作為模擬運動的一種方式，近年來已被應用于骨骼肌衛(wèi)星細胞的研究。有研究表明，機械牽拉能夠促進骨骼肌衛(wèi)星細胞的激活和增殖（Kook et al.，2008），抑制分化（史仍飛等，2012），并且與牽拉程度存在相關性。然而，機械牽拉對骨骼肌衛(wèi)星細胞的調節(jié)機制尚未闡述清楚。因此，本實驗通過離體培養(yǎng)骨骼肌衛(wèi)星細胞，研究機械牽拉對骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖的作用，初步探究可能的作用途徑，為骨骼肌損傷修復及細胞肥大過程提供理論依據(jù)。

1 研究對象與方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性 SD 大鼠 2 只，2～3 周齡，體重 90 g，由上海實驗動物研究中心提供，SCXK（2013-0016）。

1.2 主要實驗試劑

DMEM 培養(yǎng)液（Gibco）、胎牛血清（Gibco）、馬血清（Gibco），青霉素、鏈霉素（Amresco）、Ⅱ型膠原酶（Sigma）、胰酶（Gibco）、CCK-8 試劑盒（日本同仁堂）、α 橫紋肌肌動蛋白（武漢博士德）、SABC 試劑盒（武漢博士德）、DAB試劑盒（武漢博士德）。

1.3 骨骼肌衛(wèi)星細胞原代培養(yǎng)

10% 的水合氯醛以0.4 ml/100 g 的劑量腹腔注射麻醉大鼠，約5 min 后，待其疼痛反射和角膜反射均消失后，浸泡至75% 的酒精中，2 min 后，仰臥位固定大鼠。在無菌條件下分離雙側腿部比目魚肌、腓腸肌和背部肌肉。去除筋膜、血管、脂肪等組織，充分剪碎至1 mm3。在剪碎的肌肉中加入0.1%Ⅱ型膠原酶30 ml，在37℃條件下攪拌器攪拌 1 h，1 000 轉/分離心 15 min 后，棄上清。再加入 0.25%胰酶30 ml，37℃消化15 min，胎牛血清終止消化，1 000 轉/分離心15 min，棄上清。加入種植培養(yǎng)液吹打混勻，依次通過100 目、200 目、400 目細胞篩過濾。接種于未經多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2，100% 空氣濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2 h 后將培養(yǎng)瓶中的細胞懸液置于未經多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中。2 h 后，將第一次差速貼壁完的細胞接種于經多聚賴氨酸的包被的培養(yǎng)瓶中，24 h后首次換液，之后每2 天換1 次液。

1.4 骨骼肌衛(wèi)星細胞傳代培養(yǎng)

吸出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，PBS 清洗2 次，棄去PBS。加入0.25% 胰蛋白酶2 ml，37℃消化2 min，并用巴氏吸管充分吹打瓶壁，待大部分細胞從瓶壁上脫落時，加入1 ml 胎牛血清終止消化，1 000 轉/分離心10 min。棄上清，加生長培養(yǎng)液充分吹打制成細胞懸液后，接種到新的培養(yǎng)瓶中。

1.5 骨骼肌衛(wèi)星細胞純度鑒定

取第三代的細胞，將細胞密度調至3×105個/孔，接種于放有蓋玻片12 孔板內，將培養(yǎng)板置于37℃，5%CO2，100% 空氣濕度細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出12 孔板，用PBS漂洗3次。4%多聚甲醛固定為20 min，用PBS漂洗3次，3 min/次。 以 75%、85%、95% 濃度酒精依次脫水，3 min/次，用 PBS 漂洗 3 次，3 min/次。3% H2O2滅活內源性的過氧化物酶，室溫浸泡 30 min，用 PBS 漂洗 3 次，3 min/次。滴加5% BSA 封閉液，室溫孵育20 min，除去多余液體。滴加一抗（1：100 稀釋的橫紋肌肌動蛋白抗體），4℃過夜，用PBS 漂洗3 次，3 min/次。滴加二抗（生物素化山羊抗小鼠Ig G），37℃孵育 20 min，用 PBS 漂洗 3 次，3 min/次。滴加復 合 SABC，37℃ 孵 育 20 min，PBS 洗 滌 3 次 ，5 min/次 。DAB 顯色后，蘇木素復染2 min。取出玻片，脫水，透明，封片。顯微鏡下觀察，隨機選取6 個視野拍照，計算細胞純度。細胞純度（100%）=（細胞總數(shù)-陰性細胞數(shù)）÷細胞總核×100%。

1.6 骨骼肌衛(wèi)星細胞的機械牽拉

取第三代細胞，將衛(wèi)星細胞的密度調制2×105個/ml后種植在牽拉板，在牽拉板上繼續(xù)培養(yǎng)24 h 使細胞完全貼壁，然后對細胞以1 Hz 的頻率進行周期性機械牽拉。將細胞分組如下：

對照組（C）：不施加任何牽拉；

5% 拉伸度 4 h 組（5%S 4 h）：以 5% 的機械牽拉強度牽拉4 h；

5% 拉伸度 6 h 組（5%S 6 h）：以 5% 的機械牽拉強度牽拉6 h；

15% 拉伸度 4 h 組（15%S 4 h）：以 15% 的機械牽拉強度牽拉4 h；

15% 拉伸度 6 h 組（15%S 6 h）：以 15% 的機械牽拉強度牽拉6 h。

1.7 CCK-8檢測骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖

牽拉結束后放置培養(yǎng)箱中，24 h 后換液，每孔加入1 ml生長培養(yǎng)液和100 ulCCK8 溶液使其完全覆蓋細胞，并輕輕搖晃均勻，孵育2 h 后，將待測液加入96 孔板中，以吸光度為 450 nm 測定 OD 值。

1.8 Western blotting

除去牽拉板中的生長培養(yǎng)液，用預冷的PBS 清洗3 次。在每孔中加入80 μl細胞裂解液，靜置于冰袋上，孵育30 min，用細胞刮板刮凈，收取細胞。4℃離心機上12 000轉/分離心20 min。-80℃保存，待測。采用BCA 法測定細胞的總蛋白含量后蛋白變性。然后進行8% 的SDS-PAGE 電泳，將目的條帶轉至PVDF 膜，使用5% 脫脂牛奶封閉，然后4℃孵育一抗過夜，TBST 清洗后，室溫孵育二抗2 h，ECL 超敏試劑盒顯影，掃描圖片，分析蛋白相對表達量。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS17.0 軟件，分析實驗數(shù)據(jù)均以M±SD表示。針對不同牽拉強度和牽拉時間的數(shù)據(jù)，先采用雙因素方差分析，確定牽拉強度、牽拉時間是否產生獨立作用或交互作用，針對不同因素產生的作用，進行Post Hoc 組間兩兩比較，事后檢驗采用LSD 法。采用獨立樣本t檢驗檢測不同組別與C 組的差異。P＜0.05 為顯著性差異，P＜0.01為非常顯著性差異。

2 實驗結果

2.1 骨骼肌衛(wèi)星細胞的形態(tài)學觀察

A：骨骼肌衛(wèi)星細胞貼壁1d，細胞體積小，呈圓形，折光性強（40×）；

B：骨骼肌衛(wèi)星細胞貼壁2d，部分細胞呈長梭形（40×）；

C：骨骼肌衛(wèi)星細胞貼壁4d，細胞增多，細胞體積變大，部分細胞呈梭形或多角形（40×）；

D：骨骼肌衛(wèi)星細胞貼壁6d，細胞明顯增多，密集呈網狀，相互融合（40×）。

2.2 骨骼肌衛(wèi)星細胞的鑒定

本實驗計數(shù)1 000 個細胞，陰性細胞數(shù)為24 個。

細胞純度（100%）=（1 000-24）/1 000×100%=97.6%

細胞純度≥95%，達到的純化的要求。

2.3 不同機械牽拉強度對骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖的影響

如圖2 所示，雙因素方差分析顯示，不同的牽拉強度對骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖作用顯著（P＜0.05）。15% 牽拉強度比5% 牽拉強度促增殖效果更好（P＜0.01）。

圖2 機械牽拉對骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖的影響Figure 2. Effects of Mechanical Stretch on the Proliferation of Skeletal Muscle Satellite Cells

與C 組相比，15%S 4 h 組和15%S 6 h 組均能促進骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖（P＜0.01），5%S 4 h 組和5%S 6 h 組的骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖沒有顯著性變化。

2.4 機械牽拉對骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖相關蛋白的影響

2.4.1 牽拉結束即刻Akt、P38、ERK、JNK的變化

如圖 3 所示，不同牽拉強度對 Akt、P38、JNK 的磷酸化作用顯著（P＜0.05）。與5% 牽拉強度相比，15% 牽拉強度活化Akt、P38、JNK 效果更好（P＜0.01）。不同牽拉強度和牽拉時間均對ERK 的磷酸化作用顯著（P＜0.01），且兩者之間出現(xiàn)交互作用（P＜0.05），ERK 的磷酸化結果顯示5%S 6 hvs15%S 6 h（P＜0.01）、5%S 4 hvs15%S 4 h（P＜0.05）、15%S 4 hvs15%S 6 h（P＜0.01）、5%S 6 hvs15%S 4 h（P＜0.01）。

15%S 4 h 組和 15%S 6 h 組的 Akt、P38、ERK、JNK 的磷酸化在牽拉結束即刻顯著高于C 組（P＜0.01），5%S 4 h 組和 5% 6 h 組的 Akt、P38、ERK、JNK 的磷酸化水平在牽拉結束即刻與C 組相比未有顯著變化。

2.4.2 牽拉結束24 h后Myf5和MyoD的蛋白表達

如圖4，不同的牽拉強度和牽拉時間對Myf5 和MyoD 作用不顯著，且牽拉時間與牽拉強度之間沒有出現(xiàn)交互作用。

如圖 4A，與 C 組相比，15%S 6 h 組 Myf5 蛋白表達顯著增加（P＜0.01），5%S 4 h 組、5%S 6 h 組、15%S 4h 組的Myf5 蛋白表達均無顯著性差異。如圖4B，與C 組相比，15%S 4 h 組和15%S 6 h 組的MyoD 的蛋白表達顯著增加（P＜0.01），5%S 4 h 組、5%S 6 h 組的 MyoD 的蛋白表達無顯著變化。

2.4.3 牽拉結束24 h后Akt、P38、ERK、JNK的變化

不同牽拉強度和牽拉時間對Akt 的磷酸化沒有顯著影響，但牽拉強度和牽拉時間的交互作用顯著（P＜0.05），Akt 的磷酸化結果顯示 5%S 6 hvs15%S 6 h（P＜0.01）、15%S 4 hvs15%S 6 h（P＜0.05）、15%S 6 hvs5%S4 h（P＜0.01）、5%S 6 hvs15%S 4 h（P＜0.05）。不同牽拉強度和牽拉時間對P38、ERK 和JNK 的磷酸化沒有顯著影響，同時牽拉時間與牽拉強度之間均沒有出現(xiàn)交互作用。

如圖 5，牽拉結束 24 h 后，15%S 4 h 組和 15%S 6 h 組的Akt、P38、ERK、JNK 的磷酸化顯著高于C 組（P＜0.01），5%S 4 h 組和 5%S 6 h 組的 Akt、P38、ERK 和 JNK 的磷酸化未有顯著性。

3 分析討論

骨骼肌衛(wèi)星細胞是肌源性干細胞，簡稱衛(wèi)星細胞，具有極強的增殖能力。Mauro 等（1961）首次從蛙的脛骨前肌中發(fā)現(xiàn)了位于肌膜與基膜之間的衛(wèi)星細胞。此后，對衛(wèi)星細胞進行了很多研究。在成年骨骼肌中，衛(wèi)星細胞是靜止的，疾病或者損傷等一些刺激，會激活靜止的衛(wèi)星細胞，衛(wèi)星細胞通過不對稱分裂方式，一部分分裂為活化的衛(wèi)星細胞，來修復肌肉損傷，另一部分則補充衛(wèi)星細胞池，以保持細胞池的相對穩(wěn)定。

有研究表明，一次性力竭運動能夠激活靜息期的衛(wèi)星細胞，但不足以誘導其分化（Snijders et al.，2012）；短期的抗阻運動能夠使衛(wèi)星細胞數(shù)目的增加，以及肌纖維肥大（Kadi et al.，2004）；長期的力量訓練能使肌細胞核和衛(wèi)星細胞的數(shù)目增加，并且使肌纖維橫截面積增大（Snijders et al.，2009）。這些研究均證實，運動可以通過激活骨骼肌中的衛(wèi)星細胞，進而促進肌肉的肥大。機械牽拉通過模擬運動的方式，已在多種細胞研究中被應用，例如骨髓間充質干細胞、C2C12 細胞、心肌細胞、骨細胞等。其中，骨骼肌衛(wèi)星細胞對機械牽拉反應相當敏感，有學者發(fā)現(xiàn)，機械牽拉能夠導致衛(wèi)星細胞活化和增殖。許多可以調節(jié)機械轉導的細胞因子也參與了衛(wèi)星細胞活化（Thornell et al.，2003；Wang et al.，2006）。有關機械牽拉促進衛(wèi)星細胞增殖的作用機制尚未研究透徹，現(xiàn)在的大多數(shù)研究使用成肌細胞系而不是原代培養(yǎng)的衛(wèi)星細胞來探究機械牽拉在調節(jié)肌生成中的作用（Chen et al.，2007；Kumar et al.，2004）。本實驗通過體外提取具有干細胞功能的骨骼肌衛(wèi)星細胞，而不是使用被轉化的細胞系，能更好的分析關 于機械牽拉介導的肌生成的調節(jié)機制。

圖3 機械牽拉結束即刻骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖相關通路的變化Figure 3. Changes of Signaling Pathways Associated with the Proliferation of Stretch of Skeletal Muscle Satellite Cells Immediately after Mechanical Stretch

圖4 機械牽拉結束24 h后骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖相關蛋白的變化Figure 4. Changes of Protein Expressions Associated with the Proliferation of Stretch of Skeletal Muscle Satellite Cells at 24 Hours after Mechanical Stretch

3.1 機械牽拉對骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖的影響

有研究顯示，細胞對牽拉的反應與牽拉程度有關，如5% 強度周期性牽拉能促進角膜成纖維細胞的增殖，但是抑制遷移（Suetta et al.，2010）；15% 的強度持續(xù)牽拉膀胱平滑肌細胞，細胞的收縮功能先下降后上升（Honsho et al.，2009）；結締組織細胞培養(yǎng)后，給予其 10% 強度、4 h 的牽拉后，可引起細胞增殖（Hatton et al.，2003）。機械刺激可以促進大鼠肌腱干細胞的分化，4%、2 Hz 牽拉24 h 促進成腱分化，8%、1 Hz 牽拉 24 h 促進成骨分化，8%、2 Hz 牽拉48 促進成脂肪分化（李跑等，2017）。

圖5 機械牽拉結束24 h后骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖相關通路的變化Figure 5. Changes of Signaling Pathways Associated with the Proliferation of Stretch of Skeletal Muscle Satellite Cells at 24 Hours after Mechanical Stretch

有關機械牽拉對骨骼肌衛(wèi)星細胞影響的研究發(fā)現(xiàn)，10% 的周期性牽拉能夠促進牛肌衛(wèi)星細胞的增殖并抑制其分化（Kook et al.，2008）；同樣，史仍飛等（2012）發(fā)現(xiàn)5%、15%、25% 的拉伸度，頻率為1 Hz 的周期性牽拉都能促進大鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖，其中以15% 牽拉強度的增殖效果最為顯著，我們所得到的結果與上述的結果相一致。我們通過對肌衛(wèi)星細胞施加1 Hz、拉伸度為5%和15%、牽拉時間為4 h 和6 h 的的周期性牽拉，在牽拉結束24 h 后，采用CCK8 比色法檢測增殖情況，發(fā)現(xiàn)不同牽拉強度對骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖作用顯著，15% 牽拉強度比5% 牽拉強度促增殖效果更好，說明在同牽拉時間（4 h，6 h）和頻率（1 HZ）的條件下，一定范圍內增加牽拉強度，能起到促進骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖的作用。綜上所述，機械牽拉對骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖作用與牽拉強度存在相關性。15% 的牽拉度可以使肌衛(wèi)星細胞的增殖能力顯著提高，而5% 的拉伸度對肌衛(wèi)星細胞沒有促增殖作用。有其它研究發(fā)現(xiàn)5% 的拉伸度能夠促進細胞的增殖，這與我們得出的結論不一樣，推測可能是由于機械牽拉對細胞的影響會根據(jù)細胞種類、種屬來源的不同而有所不同（Bullard et al.，2007；Zhao et al.，2016）。

3.2 機械牽拉可能通過調控MyoD 和Myf5 的表達來促進衛(wèi)星細胞的增殖

骨骼肌的生成依賴生肌調節(jié)因子（MRFs）家族的參與。Myf5 和MyoD 是MRFs 中的成員，在肌肉早期發(fā)育、形成過程中起著重要的作用（陶志云等，2012）。實驗發(fā)現(xiàn)，單獨敲除MyoD 基因，出生的小鼠會有正常肌肉的形成，當同時去除MyoD 和Myf5 時，小鼠無肌肉形成（Rudnicki et al.，1994）。Myf5 是參與肌細胞增殖、分化、肌纖維形成過程中最早表達的因子，Myf5 一旦被激活，MRFs 家族的其他因子將相繼被激活，整個肌肉發(fā)育過程才能完整而順利的進行下去。Cooper 等（1999）通過實驗證實，小鼠骨骼肌再生時，肌衛(wèi)星細胞激活早期MyoD 基因，在所有增殖的肌衛(wèi)星細胞中，MyoD 也都顯著表達，因此在成體骨骼肌中，MyoD 被認為是衛(wèi)星細胞激活的一個很好的標志。活化的骨骼肌衛(wèi)星細胞中會有MyoD 和Myf5 的表達，在衛(wèi)星細胞增殖的過程中，MyoD 和Myf5 的蛋白表達增加。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，不同的牽拉強度和牽拉時間對Myf5 和MyoD作用不顯著，說明MyoD 和Myf5的蛋白表達對牽拉時間和牽拉強度的變化沒有依賴性。拉伸度為15%，在牽拉4 h 和6 h后24 h 時，MyoD 蛋白表達顯著增高，說明衛(wèi)星細胞被大量激活，進入增殖狀態(tài)，這與CCK8 測得的結果相符；Myf5 的蛋白表達在拉伸度為15%，牽拉6 h 也顯著增高。而拉伸度為15%，牽拉4 h未增高，這與CCK8結果并不統(tǒng)一，本實驗選取檢測Myf5蛋白表達的時間點是牽拉結束24 h，并未檢測牽拉結束24 以內以及牽拉結束24 以后Myf5 蛋白表達的變化，推測出現(xiàn)此種結果的原因可能是Myf5 的蛋白表達處于升高階段，還未到達峰值，具體原因需通過進一步實驗來獲取。

3.3 機械牽拉可能通過調控Akt、P38、ERK、JNK 通路來調節(jié)骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖

PI3K/Akt/mTOR 通路是影響蛋白變化的關鍵通路，并且參與機械牽拉引起細胞增殖的過程。Akt 是PI3K 下游的關鍵效應分子，Akt 被激活后，磷酸化水平升高，進而激活下游的 mTOR，促進肌肉的合成（Rommel et al.，2001）。一定程度的機械牽拉能夠通過活化Akt 的途徑來促進心肌的肥大；有研究表明，10% 的拉伸度能顯著提高血管平滑肌的Akt 活性，并且這種變化對時間有依賴性（Won et al.，2013）；相同的，15% 的拉伸度牽拉主動脈平滑肌，持續(xù)6 h，能激活 PI3K/Akt 通路（Liu et al.，2015）。Akt 的活化被證實與肌肉的存活和凋亡密切相關，機械牽拉引起骨骼肌的質量改變也是通過PI3K/Akt/mTOR 這條通路介導的（Chen et al.，2014）。對C2C12細胞進行周期性牽拉僅30 min，就能引起mTOR 下游蛋白p70S6K 的磷酸化，進而促進肌肉的合成（Alexander et al.，2004）。由此可以推測，機械牽拉促進骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖作用可能是通過PI3K/Akt/mTOR/p70S6K 這條通路介導的。

MAPK（絲裂素活化蛋白激酶）通路是參與細胞應激和損傷反應的主要信號通路，能將多種細胞外刺激產生的信號從細胞膜外傳遞到細胞核內，在細胞的增殖、分化和對外環(huán)境應激中起著非常重要的作用（Amiram et al.，2013）。 在哺乳動物體內主要有 ERK 通路、JNK 通路和P38 通路，這些信號的傳導對細胞調節(jié)具有重要的影響。ERK 通路是MAPK 家族中研究最早的通路，許多細胞外刺激可以激活ERK 通路，以Ras/Raf/MEK/ERK 這條通路最為常見，活化后的ERK 移動到細胞核，活化眾多與細胞功能相關的轉錄因子，進而對細胞進行調控。JNK 通路可被多種因子激活，例如，LPS、TNF-α、JNK 可從胞漿進入細胞核，與轉錄因子結合，調控細胞相關基因的表達（Weston et al.，2002）。P38 通路被認為是 MAPK 家族中最經典的通路，P38 一般位于靜止細胞的胞質和胞核，被激活后形成pP38，進而激活多種轉錄因子，誘導細胞表面基因表達，加速蛋白合成和細胞骨架重構（Chen et al.，2011）。

機械牽拉能夠通過激活細胞內的MAPK 通路，來促進蛋白的合成。15% 拉伸度的機械牽拉可以激活C2C12 細胞中 P38、ERK、JNK 的磷酸化（Nakai et al.，2010）；人的成纖維細胞接受10% 的機械牽拉后，P38 的活化顯著增高；有關大鼠平滑肌的調查發(fā)現(xiàn)，20% 的拉伸度牽拉5～10min就可以使 P38 和 JNK 的活性顯著升高（Xu et al.，2012）；對牛內皮細胞進行周期性拉伸，JNK、ERK 和P38 的磷酸化水平都顯著升高（Kito et al.，2000）。 這些結果都表明，MAPK 家族在機械牽拉調控的細胞增殖中具有重要的作用。

本實驗中，在牽拉結束即刻，不同牽拉強度對Akt、P38、JNK 的磷酸化作用顯著。與5% 牽拉強度相比，15%牽拉強度活化Akt、P38、JNK 效果更好，說明在同牽拉時間（4 h，6 h）和頻率（1 HZ）的條件下，一定范圍內增加牽拉強度能使Akt、P38、JNK 活化增加；不同牽拉強度和牽拉時間均對ERK 的磷酸化作用顯著，推測ERK 通路的活化對牽拉強度與牽拉時間的變化均有依賴性，在同牽拉時間（4 h，6 h）和頻率（1 HZ）的條件下，一定范圍內增加牽拉強度，或者同牽拉強度（5%，15%）和頻率（1 HZ）的條件下，一定范圍內延長牽拉時間，可能使ERK 的活化增加。5%S 4 h 組和 15%S 6 h 組的 Akt、P38、ERK、JNK 的磷酸化顯著高于C 組。由此可以看出，在牽拉結束即刻這個時間點，骨骼肌衛(wèi)星細胞內與增殖相關的部分蛋白磷酸化就已升高，根據(jù)牽拉結束 24 h 后，15%S 4 h 組和 15%S 6 h 組的 Akt、P38、ERK、JNK 的磷酸化依然顯著高于 C 組的結果，可推測，與骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖相關的磷酸化蛋白在牽拉即刻就可開始升高，部分蛋白的磷酸化可能持續(xù)增高直到牽拉結束24 h 后。當然也有截然不同的研究結果，通過培養(yǎng)大鼠膀胱平滑肌細胞后進行牽拉發(fā)現(xiàn)，機械牽拉對與細胞生長密切相關的ERK 通路無關，而與P38 通路和 JNK 通路密切相關（Nguyen et al.，2000）。機械牽拉使牛的肌衛(wèi)星細胞中ERK 的磷酸化水平顯著增高，而P38的磷酸化水平呈降低的趨勢。這些都有可能是由于細胞的類型或者是種屬的不同，而產生不同的結果。

本實驗的結果表明，15% 拉伸度牽拉4 h 和6 h，均可以骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖，在牽拉結束即刻Akt、P38、ERK、JNK 的活性已經顯著升高，并且在牽拉結束24 h 后，Akt、P38、ERK、JNK 的活性依然呈現(xiàn)顯著升高的狀態(tài)。以往的研究只是對選取某個時間點進行研究，而本研究選取了牽拉結束即刻和牽拉結束24 h 后這2 個時間點進行比較，能更好的探究與骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖相關的通路蛋白的變化，這也是本文的創(chuàng)新點。由于條件限制，本研究并未使用各個通路蛋白的特異性抑制劑進行研究，也沒有檢測各個通路下游蛋白的表達，因此只能得出初步結論。

4 結論

1）15% 的拉伸度，牽拉4 h 和6 h 可以促進體外培養(yǎng)的大鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖。

2）機械牽拉可能是通過激活Akt、P38、ERK、JNK 這些通路來促進骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖的。