黃自坤，張 露，曾璐璐，羅 清

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是一種病因不明的,以免疫性炎癥為突出表現(xiàn)的系統(tǒng)性自身免疫病，好發(fā)于育齡期婦女[1]。目前用于診斷的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)主要為自身抗體，但是自身抗體敏感性較低，患者中陽性率也較低，有一定的誤診和漏診[2-3]。環(huán)狀RNA是最近新發(fā)現(xiàn)的區(qū)別于傳統(tǒng)線性RNA的一類特殊RNA，主要由mRNA前體通過可變剪切加工產(chǎn)生，具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)[4]。此外，這使得環(huán)狀RNA在作為新型臨床生物標(biāo)記物的開發(fā)應(yīng)用上具有明顯優(yōu)勢。環(huán)狀RNA在多種疾病[5-7]的診斷、療效判斷、監(jiān)測復(fù)發(fā)上的作用已得到證實(shí)，在SLE中的作用也逐漸得到大家的認(rèn)識(shí)[8]。該研究首次以外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)環(huán)狀RNA hsa_circ_104871為研究目標(biāo)，探討其在SLE診斷和鑒別診斷中的價(jià)值和意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料70例SLE患者來自南昌大學(xué)第一附屬院風(fēng)濕免疫科2017年1月～2019年3月期間住院患者，其中男5例，女65例；年齡11～75(40.8±14.6)歲，臨床診斷符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)1997年修訂的分類標(biāo)準(zhǔn)[9]，并排除嚴(yán)重糖尿病、高血壓、高血脂、心腦血管疾病、肝腎疾病、血栓性疾病、血小板疾病等其他疾病。健康對照組70例，均為健康志愿者，排除炎癥或其他自身免疫性疾病，其中男10例，女70例；年齡22～74(38.4±11.3)歲。兩組性別、年齡無顯著性差異。詳細(xì)收集SLE患者臨床資料及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查數(shù)據(jù)，并計(jì)算其SLE疾病活動(dòng)指數(shù)(systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI)[10]。此外，選取同期收治的76例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)作為RA疾病對照組，其中男14例，女62例；年齡16～79(54.9±12.3)歲。臨床診斷符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)1987年修訂RA診斷標(biāo)準(zhǔn)[11],并排除其他疾病。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者和健康人均簽署知情同意書。

1.2 試劑和主要儀器Ficoll分離液購自美國Sigma公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；去除DNA的PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR ? Premix Ex Taq TM購自大連寶生物TaKaRa公司；hsa_circ_104871及內(nèi)參基因β-actin引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Nanodrop ND-1000 紫外分光光度計(jì)購自美國Nanodrop公司；Applied Biosystems 7500型熒光定量PCR儀器購自美國ABI公司。

1.3 PBMC提取采集受試者清晨空腹EDTA抗凝外周血2 ml，6 h內(nèi)送檢。采用Ficoll分離液分離PBMC，用TRIzol試劑處理，放-80 ℃冰箱保存。

1.4 PBMC總RNA提取按TRIzol試劑說明書分別提取SLE組患者、RA疾病對照組和健康對照組PBMC中的總RNA,焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的蒸餾水溶解 RNA,采用RNA純化試劑盒純化總RNA。進(jìn)一步使用Nanodrop ND-1000紫外分光光度計(jì)對總RNA進(jìn)行定量和質(zhì)量分析。

1.5 RT-PCR檢測采用RT-PCR SYBR Green法，以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行hsa_circ_104871的檢測。提取PBMC中的總RNA，DEPC水溶解后，取 1 μl RNA，利用 PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用20 μl反應(yīng)體系進(jìn)行檢測，PCR引物序列見表1。反應(yīng)體系包括：1 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、0.5 μmol/ L上游引物、0.5 μmol/L下游引物、1×SYBR熒光染料試劑。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，72 ℃、30 s，40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。所有樣品做3個(gè)復(fù)孔。RT-PCR使用ABI7500儀器進(jìn)行。分析待測標(biāo)本的擴(kuò)增熔解曲線，均為單峰，無非特異性擴(kuò)增。根據(jù)待測標(biāo)本的Ct值，采用相對定量法對RT-PCR結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)算2-ΔCt。引物序列見表1。

表1 熒光定量 PCR 引物序列

1.6 SLE相關(guān)的其他指標(biāo)檢測方法IgG、C3、C4、CRP采用速率散色比濁法(試劑和儀器購自美國Beckman Coulter公司)；抗ds-DNA采用酶聯(lián)免疫吸附法(試劑購自上?？菩律锛夹g(shù)股份有限公司)；抗ENA抗體采用免疫印記法檢測(試劑和儀器均購自德國歐蒙公司)；ESR采用動(dòng)態(tài)血沉儀法(儀器購自北京普利生公司)；血常規(guī)采用電阻抗法(試劑和儀器購自日本希森美康公司)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)，兩組樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，否則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。兩個(gè)變量之間相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。受試者工作特征(receiver operator characteristic, ROC)曲線分析評(píng)價(jià)circRNA診斷和鑒別診斷的敏感性和特異性。以雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SLE組患者和健康對照組PBMC中環(huán)狀RNA hsa_circ_104871中表達(dá)的比較SLE組患者PBMC中環(huán)狀RNA hsa_circ_104871表達(dá)水平顯著低于健康對照組，分別為(0.000 72±0.000 73)和(0.001 17±0.000 75)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.57，P=0.000 5)。見圖1。

圖1 SLE組患者和健康對照組 PBMC中環(huán)狀RNA hsa_circ_104871表達(dá)與健康對照組比較：***P<0.001

2.2 SLE組患者和RA疾病對照組PBMC中環(huán)狀RNA hsa_circ_104871表達(dá)的比較SLE組患者PBMC中環(huán)狀RNA hsa_circ_104871表達(dá)水平顯著低于RA疾病對照組，分別為0.000 52(0.000 29，0.000 81)和0.000 95(0.000 58，0.001 45)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=1 472，P<0.000 1)。見圖2。

2.3 SLE組患者和對照組(健康對照者+RA疾病對照者)PBMC中環(huán)狀RNA hsa_circ_104871表達(dá)的比較SLE患者PBMC中環(huán)狀RNA hsa_circ_104871表達(dá)水平顯著低于對照組，分別為0.000 52(0.000 29，0.000 81)和0.000 90(0.000 63，0.001 45)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=2 654，P<0.000 1)。見圖3。

圖2 SLE組患者和RA疾病對照組 PBMC中環(huán)狀RNA hsa_circ_104871表達(dá)與RA疾病對照組比較：***P<0.001

圖3 SLE組患者和對照組PBMC中 環(huán)狀RNA hsa_circ_104871表達(dá)與對照組比較：***P<0.001

2.4 PBMC中環(huán)狀RNA hsa_circ_104871表達(dá)水平與SLE患者臨床參數(shù)之間相關(guān)性分析SLE患者PBMC環(huán)狀RNA hsa_circ_104871表達(dá)水平與PLT呈正相關(guān)(r=0.290 0，P=0.015 7)(圖4)，而與其他臨床指標(biāo)(SLEDAI，ESR，C3，C4，自身抗體等)不相關(guān)。

2.5 PBMC中環(huán)狀RNA hsa_circ_104871對SLE診斷的價(jià)值為評(píng)估PBMC中環(huán)狀RNA hsa_circ_104871對SLE的診斷價(jià)值，對SLE患者和健康對照者的PBMC中環(huán)狀RNA hsa_circ_104871表達(dá)水平進(jìn)行ROC曲線分析，ROC曲線AUC為0.759(95%CI:0.677～0.841;P<0.000 1)，Cut-off值為0.000 620 2，敏感性為64.29%，特異性為81.43%，陽性預(yù)測值為66.18%，陰性預(yù)測值為72.83%，約登指數(shù)為0.457。見圖5。

圖4 SLE組患者PBMC中環(huán)狀 RNA hsa_circ_104871表達(dá)水平與PLT的相關(guān)性分析

圖5 SLE組患者與健康對照組PBMC中環(huán)狀 RNA hsa_circ_104871的ROC曲線分析

2.6 PBMC中環(huán)狀RNA hsa_circ_104871對SLE與RA鑒別診斷的價(jià)值對SLE組與RA疾病對照組PBMC中環(huán)狀RNA hsa_circ_104871的表達(dá)水平進(jìn)行ROC分析，AUC為0.727(95%CI: 0.645～0.809;P<0.000 1)，Cut-off值為0.000 697 8，敏感性為70.00%，特異性為66.23%，陽性預(yù)測值為65.33%，陰性預(yù)測值為70.83%，約登指數(shù)為0.362；對SLE與對照組PBMC中環(huán)狀RNA hsa_circ_104871的表達(dá)水平進(jìn)行ROC分析，AUC為0.742(95%CI:0.666～0.818;P<0.000 1)，Cut-off值為0.000 628 9，敏感性為65.71%，特異性為74.80%，陽性預(yù)測值為54.76%，陰性預(yù)測值為82.48%，約登指數(shù)為0.405。見圖6。

3 討論

目前，SLE診斷的必要條件是抗核抗體譜，包括抗雙鏈DNA抗體、抗核抗體、抗可提取性核抗原抗體等，其中抗雙鏈DNA抗體(anti-dsDNA)、抗史密斯抗體(anti-Sm)和抗核小體抗體是SLE的標(biāo)志性抗體[2-3，12]，對于SLE的診斷具有很好的特異性。但這些指標(biāo)診斷SLE的敏感性都不理想，其中抗核小體抗體的敏感性最強(qiáng)，但也只有約60%，anti-dsDNA的敏感性低于50%，而anti-Sm抗體的敏感性只有10%～30%[2，12]。因此，臨床上目前仍缺乏理想的SLE診斷標(biāo)志物。

圖6 SLE組患者分別與RA疾病對照組和對照組 PBMC中環(huán)狀RNA hsa_circ_104871的ROC曲線分析

A：RA疾病對照組；B：對照組(健康對照者+RA疾病對照者)

研究[13]表明，環(huán)狀RNA在血液中可長期穩(wěn)定存在，RNA酶降解作用、煮沸、反復(fù)凍融、酸堿環(huán)境、長期保存等各種處理方法均不會(huì)造成血液環(huán)狀RNA的損失，比較適宜作為基本的臨床診斷標(biāo)志物。近期，國內(nèi)外均有學(xué)者嘗試探討環(huán)狀RNA作為自身免疫性疾病診斷標(biāo)志物的可行性，并取得了可喜的成果[6-7，14]。此外，Li et al[8]采用高通量基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)SLE患者血漿環(huán)狀RNA表達(dá)譜發(fā)生顯著變化，表明環(huán)狀RNA可作為SLE的潛在診斷標(biāo)志物。

關(guān)于環(huán)狀RNA hsa_circ_104871是否可作為SLE潛在的診斷標(biāo)志物，本研究結(jié)果顯示SLE組患者PBMC中hsa_circ_104871表達(dá)水平降低，進(jìn)一步分析SLE組PBMC中hsa_circ_104871表達(dá)的臨床意義，結(jié)果顯示其表達(dá)水平與SLE患者的PLT數(shù)量呈正相關(guān)，說明hsa_circ_104871表達(dá)水平與疾病嚴(yán)重程度呈反比，患者疾病越嚴(yán)重，hsa_circ_104871分子的表達(dá)水平越低。另外，ROC曲線分析表明，hsa_circ_104871可有效地從健康對照者中診斷出SLE患者，其敏感性為64.29%，而特異性可達(dá)到81.43%。

SLE可累及關(guān)節(jié)，患者經(jīng)常會(huì)有關(guān)節(jié)疼痛等癥狀，臨床上容易與RA混淆，為此該文比較了SLE患者與RA患者PBMC中hsa_circ_104871的表達(dá)水平，SLE患者PBMC中hsa_circ_104871表達(dá)水平顯著低于RA疾病對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步的ROC曲線分析證實(shí)其可有效將SLE患者與RA患者區(qū)別開來，可用于SLE與RA的鑒別診斷。此外，本研究還顯示RA患者的PBMC中hsa_circ_104871表達(dá)水平與健康對照者無差異，這與Ouyang et al[6]研究結(jié)果不一致，Ouyang et al[6]研究分析了30例健康對照者和35例初診的RA患者PBMC中hsa_circ_104871表達(dá)水平，結(jié)果表明RA患者PBMC中的hsa_circ_104871表達(dá)水平明顯高于健康對照者，但也未顯示RA患者PBMC中的hsa_circ_104871表達(dá)水平與疾病活動(dòng)度等臨床指標(biāo)相關(guān)，ROC曲線分析表明RA患者PBMC的hsa_circ_104871表達(dá)水平對RA的診斷效能較好，敏感性為83.30%，特異性為68.00%。這其中的差異可能源自：① 不同 RA 患者異質(zhì)性較大；② 本文收集的RA病例并非均是初診未治療的，藥物可能對其表達(dá)有影響；③ 自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜。

本研究尚存在一些不足：① SLE患者的研究樣本不夠多；② 沒有檢測治療前后以及初診和復(fù)診患者之間hsa_circ_104871的表達(dá)差異，無法明確其在預(yù)后監(jiān)測中的療效。在后續(xù)的研究中將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量檢測SLE患者PBMC hsa_circ_104871的表達(dá)，使研究結(jié)果更具有可靠性。